据Insight 数据库显示，过去十年国内抗体类临床项目涉及将近150个靶点。其中TOP20的靶点占总临床项目数的62%，可见靶点选择的重复和扎堆。 以PD-1为例，目前国内在研的PD-1产品的企业有100多家，进入临床阶段的PD-1则超过50款，国产获批上市的5款,还有4款处在上市申请中。PD-1赛道早已成为一片红海。另一个理想的肿瘤药靶点Claudin 18.2亦有此趋势 , 目前进入临床阶段的Claudin 18.2 靶点药物已接近20款，公开布局的企业超过30家。
图1：赛道竞争激烈/ 图片来源Unsplash
7月2日，CDE发布了《以临床价值为导向的抗肿瘤药物临床研发指导原则》。 通告指出：试验设计选择阳性对照药时，应关注阳性对照药是否反映和代表了目标适应症患者的最佳用药情况。 这也意味着，后续同靶点同适应症的药物研发直面的竞争越来越激烈。 延伸到早期工艺开发，包括对细胞株、培养工艺和下游纯化以及制剂工艺的开发和优化要求亦会越来越高。
图2： CDE官网通告
在细胞培养工艺中，pH和溶氧是关键过程参数，进行实时监测与调控已成共识。CO2或因为早期工艺开发使用的反应器体积小，不易聚积而被忽视，或因鲜有相关在线监测和调控的研究与实践参考，一般作为调节pH的通气策略，没有作为实时在线监测的参数进行调控。然而CO2积聚对工艺放大和后期大规模生产的影响越来越受重视， 尤其是当下工艺优化后总细胞量和活细胞量不断提高，商业化生产反应器体积不断增大的情况下。在线测量CO2的必要性也被广泛的讨论。
以CHO细胞为例：在由糖酵解和三羧酸循环组成的需氧中心碳代谢网络中， CO2在多种可逆和不可逆的反应中都会产生和被消耗。通常可以简单理解为细胞呼吸，消耗一份O2，产生一份CO2 。而CO2作为不带电的极性分子，能够自由的透过细胞膜，改变细胞内的pH值， 且这一过程绕开了细胞膜正常用来控制H+浓度的机制（离子转运通道）。过低或过高的CO2水平引起的细胞内pH值变化导致细胞的生长和生产受到影响。
图3： 溶解的CO2能够自由通过细胞膜，影响胞内pH值
Brunner 的团队通过新型分离控制策略在CHO 细胞中研究了单因素pH( 6.8, 7.0 和7.2 ) ， pCO2 ( 5%, 12.5% 和20%) ，pO2及其交互作用对细胞生长及蛋白质量的影响。试验表明，pCO2 既不能太高，也不能太低，在12.5% （94mmHg）时活细胞数最高 （图4）。
图4：pH, pCO2和pO2对活细胞（VCD）的影响
Brunner的研究中，CHO表达的蛋白半乳糖化（G1）和盐藻糖化（aF1）在pH为7.2时，水平最高（图5A）且与唾液酸化（S1）和甘露糖（Man 8）具有相关性（图5C）,但 G1 随着pH和pCO2的变化则较为复杂，当pH为7.2，pCO2控制在12.5%，蛋白的半乳糖化G1 水平最高，不能太高（pCO2为20%时，G1水平只有21%）也不适宜太低 (图5B)。再一次印证了pCO2关联影响pH 进而影响细胞生长和蛋白翻译后修饰。
图5：pH, pCO2和pO2对蛋白半乳糖化（G1）, 唾液酸化（S1）和盐藻糖化（aF1）的影响
在工艺开发阶段，台式生物反应器体积小，CO2积聚少，对工艺的影响确实会被忽视。随着活细胞总量不断提高，细胞呼吸产生的CO2增多。同时反应器体积增大，CO2在反应体系中的滞留时间增加，导致培养体系中积聚的CO2更多。 从而需要工艺开发人员在早期就把CO2这一关键过程参数纳入DoE试验中，探索合理的设计空间，才不会在后续工艺放大和生产中遇到技术转移的问题。
图6： 测量溶解CO2的原因
相比于pH和溶解氧可以借助在线传感器很方便地进行实时监测， CO2的测量主要是采用血气分析仪进行离线取样测量，测量CO2分压，即pCO2。然而离线取样测量一来受取样操作的限制，需要在规定的流程和时间要求下完成测量，无法准确反应培养体系中溶解的CO2，即dCO2情况；另一方面，作为动态变化的参数，取样无法实时测量，从而无法充分获得工艺中dCO2的动态变化进而无法及时进行调控。
梅特勒-托利多创新地突破技术限制，发明了可应用于反应器中在线监测dCO2的传感器。探头式的设计可直接安装在早期工艺开发用的小型台式生物反应器，也可以通过传感器护套， 安装在后续放大生产用的大型生物反应器，实现无缝放大。在线dCO2传感器很大程度上解决了无法准确、实时测量并参与调控的困扰。现阶段，梅特勒-托利多的在线dCO2传感器已经有一定的应用基础和良好的用户反馈。
图7： 在线dCO2传感器（右）经验证可表征工艺中CO2的变化
回顾CDE发布的一系列指导原则，从长远来看，无论是创新药或类似药，患者对疗效更好，治疗费用更易承担的药物的需求必然会驱动药企从早期工艺开发、放大和技术转移等环节，更加重视关键过程参数的监测，尤其是那些还在离线测量的参数。
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