还原糖（以葡萄计）测定方法的比较研究
摘要:采用MBTH法、3,5一二峭基水杨酸(DNS )法、铁氰化钾法和酶电极法（葡萄糖氧化酶）分别测定了葡萄糖、木糖、岩藻、阿拉伯糖,N一乙酞氨基葡萄糖、氨基葡萄糖六种还原糖。通过对侧定结果的比较分析表明:MBTH法测还原糖的精密度和回收率与DNS法和铁氰化钾法相近;MBTH法测还原糖的灵敏度最高，铁氰化钾法次之，DNS法最低，酶电极法对葡萄糖的专一最强，回收率最高。
关键词:还原糖，葡萄糖，3一甲基一2一苯并味吹酮膝( MBTH ) , 3 , 5一二峭基水杨酸(DNS)，铁氰化钾、酶电极法（GOD）
多糖水解酶的活力大多通过测定水解产生的还原糖的量来确定，但到目前为止，由于还原糖测定灵敏度的问题，很难测到相应的酶解初速度，从而给多糖水解酶，特别是非淀粉多糖水解酶的生产和经营的质量控制带来混乱。因此，还原糖测定方法的优化是多糖水解酶活力测定的基础。目前还原糖大多用3,5一二硝基水杨酸( DNS )法来测定，此法的检测浓度范围较宽，方法简便，便于还原糖大批量测定。铁氰化钾法也是还原糖测定的经典方法，此法灵敏度高于DNS法，适合还原糖微量测定。3一甲基-2一苯并哗哇酮踪( MBTH)法是还原糖测定的新方法。MBTH是Besthorn于1910年首次合成的。当Huning和Fritsch `a)提出MBTH能与酚类、芳香胺类、杂环化合物和具有活性亚甲基基团的化合物反应生成有色化合物之后，MBTH多被用来检测酚类和醛类化合物，以及酶和锰过氧化物酶活力。自Sickish在1961年发现MBTH可以作为一种高灵敏的分析化学试剂来检测含羰基的化合物，并用分光光度法测定之后，MBTH则被广泛应用于其他化合物的检测。本文采用DNS法、铁氰化钾法、MBTH法测定葡萄糖、木糖、岩藻糖、阿拉伯糖、N一乙酞氨基葡萄糖、氨基葡萄糖六种广泛存在且具有代表性的还原糖，比较三种方法的精密度、灵敏度、回收率、最低检测限等，为还原糖以及相关多糖水解酶的活力测定提供参考依据。
一、实验方法
1.DNS法测各种还原糖标准曲线原理:3,5一二硝基水杨酸(3,5一dinitrosalicylic acid, DNS)在碱性条件下与还原糖的还原末端反应生成橙黄至棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈正比例关系。
方法:精密移取具有一定浓度梯度的葡萄糖、木糖、岩藻糖、阿拉伯糖、N一乙酞氨基葡萄糖、氨基葡萄糖溶液各400 微升（三组平行样)，加入0.3 mL DNS试剂，再加人10N的NaOH溶液40 微升,混匀，在沸水浴中加热15 min，取出，立即用冷水冷却至室温，冷却后加人4.75mL H20，混匀，在500nm处比色。
2铁氰化钾法测各种还原糖标准曲线原理:铁氰化钾[K,Fe(CN)6〕本身为黄色(吸收峰在420nm)左右，而与还原糖反应可生成无色的亚铁氰化钾[K4Fe( CN)6 ]，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈反比例关系。
方法:配制有一定浓度梯度的葡萄糖、木糖、岩藻糖、阿拉伯糖、N一乙酞氨基葡萄糖、氨基葡萄糖溶液，分别取I.5 mL样品溶液(三组平行样)，加人2mL铁氰化钾试剂，充分混合后，在沸水浴中加热15 min ,冷却至室温，于420nm测吸光度。
3 MBTH法测各种还原糖标准曲线原理:MBTH(3一甲基一2一苯并嘎哇酮踪，3 - methyl - 2 -benzothiazolinone hydrozone)首先与还原糖反应生成嗪，过量的MBTH被Fe3+氧化成阳离子，再与嗪反应生成青蓝色化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈正比例关系。
方法:精密吸取具有一定浓度梯度的葡萄糖、木糖、岩藻糖、阿拉伯糖、N一乙酞氨基葡萄糖、氨基葡萄糖溶液各600微升,以三组平行样)，加如600微升，0.5mol/LNaOH溶液，再加人600微升 MBTH试剂，80℃水浴中加热15 min，取出，迅速加人1.2mL硫酸铁铵试剂
室温冷却后在620nm波长下测吸光度A值。
4 酶电极法的原理：采用特殊设计的葡萄糖氧化酶膜电化学传感器对葡萄糖浓度进行检测。仪器自动采集样本并导入至测试区域。样本中所含的葡萄糖在固化的葡萄糖氧化酶的催化下发生酶解反应，反应产物为葡萄糖酸和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出葡萄糖含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本葡萄糖浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。
方法：样品水解后直接进样检测
二、结果分析
2.1 DNS法测还原糖
由于DNS法测各种还原糖的最大吸收峰不统一，因此检测波长的选择一直是DNS法研究热点。用该法测定还原糖可根据还原糖浓度在480-540nm范围内选择合适的波长。一方面，波长越短，测定灵敏度越高，越适合于检测浓度偏低的样品，但要注意本底的干扰;另一方面，波长越长，测定灵敏度越低，但标准曲线的线性范围越宽，对测定较高还原糖浓
度有利，可避免因浓度超出测定范围而造成的重复操作。经实验证实测定波长以500nm为最佳，因在此波长下本底干扰较小又不至于使其灵敏度降低过多，结果如表1和表2所示，在检测浓度范围内，DNS法测各还原糖的线性关系良好，R2> 0.998。精密度和回收率分别在0.21 %-0.78%和98.2%-103%之间，最低检测限在0.004 -- 0.144 mmol/ L之间。由回归线方程的斜率可以看出，DNS法测还原糖的灵敏度各不相同，这是因为DNS法测还原糖是在碱性条件下进行的，还原糖在碱性条件下首先发生烯醇化反应后，才具有很高的还原力。而在单糖的烯醇化历程中，质子从碳(对于葡萄糖是C2)到氧(原环内氧)的分子内迁移是决定烯醇化速率的关键步骤。以葡萄糖为例，其烯醇化历程见图1:葡萄糖环状负离子断裂后形成的2G构象中，CZ上的氢原子在空间位置上与氧负离子相距较远，不可能进行迁移。这时需
要将C2-Ci键转动成2'G构象，使C:的氢原子与氧负离子接近进行质子迁移反应。因此受化学结构的影响，不同还原糖的烯醇化速度不同，还原能力也不同。
三、结论
三种方法测还原糖的精密度和回收率都很高。同时MBTH法测各种还原糖的最低检测限在1.188--4.286 μmol/L之间，DNS法和铁氰化钾法测各种还原糖的最低检测限分别为0.004 -- 0.144mmo1/ L和0.003一 0.015mmol/L之间，由此可以看出，MBTH法的灵敏度最高，铁氰化钾法次之，DNS法的灵敏度最低。
DNS法虽然操作稳定，精密度高，但此法灵敏度相对较低，用此法测定微量多糖水解酶，如饲料添加剂中木聚糖酶活力时，则无法准确测定，这给酶制剂的生产和销售带来很大困扰。铁氰化钾法灵敏度高于DNS法，但也存在诸多弊端，如该法为逆向显色，还原糖浓度控制稍有不当或过量，即得不到任何结果。因此Park等人;对此进行了改进，建立了Park- Johnson铁氰化物法，改进后的方法为正向显色，避免了老方法较难估计待测样品浓度的弊端。但由于试剂中使用了氰化钾，使用时应注意安全。MBTH法不仅灵敏度高，而且测定不受蛋白质、醋酸盐和琉拍酸盐缓冲液的干扰，对于不同聚合度的同类还原糖，其还原端的显色吸光系数基本相同，通过实验证明，它特别适合于多糖水解酶的低酶活测定或还原糖残基摩尔吸光系数较低的情况，有利于高通量筛选，便于还原糖浓度的精密测定。但凡是与Fe反应的物质均对本法产生干扰，如EDTA或其他鳌合剂、磷酸盐、柠檬酸盐等。
酶电极法可以随时根据检验结果及时调整发酵液中糖的含量，对发酵菌种生长有利，菌丝衰老过程得到控制，效价提高。在这样的前提条件下，产量得到了提高。酶电极法适合大规模的生产，并且以淀粉水解糖、葡萄糖等为碳源的发酵工艺，并且检验人员容易掌握。而DNS约需40 min，操作环节复杂、人为因素干扰较大。