甘油-甲醇传感器在毕赤酵母表达中的应用
毕赤酵母表达系统是美国Research Corporation Technologies 公司(Tucson， AZ) 申请的专利，近年来， 随着高通量基因测序技术的不断发展，以及两种可利用的基因组浏览器(酵母菌属基因组数据库Saccharomyces Genome Database，SGD、毕赤酵母Genome Browser ) 的公开，有多种外源基因在毕赤酵母中成功获得表达，毕赤酵母表达系统逐渐成为表达外源蛋白的主导系统之一。但是作为新兴的蛋白表达系统，毕赤酵母表达系统仍存在一些缺点， 如: 筛选药物昂贵、生产过程使用的甲醇易燃等安全隐患、糖基化高甘露糖的存在以及发酵周期较长等。目前，对于毕赤酵母发酵过程中生物参数如发酵温度，培养液 pH 值， 甲醇浓度等的控制均有了比较系统的策略，因此本文主要对发酵过程中如何在生长阶段增加细胞生物量和混合碳源分批流加策略进行概述。
一、 细胞生长阶段优化
细胞生长阶段的的生长模式和状态对后期表达有着直接的影响，如果在甲醇诱导之前， 细胞处于亚健康或者非功能性状态，即使甲醇浓度得到优化，也不会获得大量外源蛋白。
1. 培养基的选择与优化
基础培养基为毕赤酵母生长提供必须的氮源、碳源、生物素等营养物质，对菌体的生长和外源蛋白的表达有直接影响。现在毕赤酵母发酵大都采用Invitrogen公司提供的缓冲甘油培养基（buffered glycerol-complex medium，BMGY）/缓冲甲醇培养基（buffered methanol-complex medium，BMMY）和最小缓冲甘油培养基（buffered minimal glycerol，BMG）/最小缓冲甲醇培养基（buffered minimal methanol， BMM），发酵罐规模的培养基大多采用成
本较低的基础盐培养基（basal salt medium，BSM）和FM22等培养基，这类培养基通常以菌体利用较快的甘油为碳源，添加各种无机盐离子以及微量元素、生物素等组成的营养盐，发酵过程中以流加氨水的方式调节pH同时补充氮源。Coso等对BSM和FM22培养基与D'ANJOU MC等设计的基础盐培养基的组分差异做了分析，指出氮源添加方式的不同会对菌体生长以及蛋白表达产生影响。以流加氨水控制pH的方式补充氮源，易形成氮源缺乏造成蛋白酶分泌量增加，从而造成外源蛋白的减产。所以，BSM和FM22这类培养基在使用过程中需要补充一定量的氮源，如（NH4）2SO4等无机氮源。但是，氮源浓度过高也会引起菌体生长的滞后。陈明祥等[5]研究了培养基中（NH4）2SO4浓度对南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase，CALB）表达量的影响，结果表明，（NH4） 2SO4质量浓度高于10 g/L时，NH4+浓度高于100 mmol/L，细胞浓度及表面展示CALB酶活力下降近30%。因此，通常控制培养基中NH4+浓度不超过100 mmol/L。
碳源是菌体生长不可或缺的结构性底物。研究发现，菌体对甘油的利用效率高于葡萄糖等碳源物质，更有利于促进细胞增殖与产物积累。所以，现在多采用甘油作为发酵核心碳源。但甘油浓度过高或过低时都会影响菌体生长，且甘油对启动子AOX有抑制作用，因此发酵过程需要严格控制甘油浓度。另外，甘油的成本较高，较大规模的工厂化发酵还需考虑成本问题，因此，工业上发酵生产附加值低的植酸酶等产品时，通常选用较廉价的葡萄糖作为碳源。
2. 发酵过程参数控制
2.1 温度
温度对毕赤酵母发酵过程中菌体的生长以及外源蛋白的表达都有重要影响。温度通过影响参与微生物体内反应的各种酶活性，进而影响菌体的生长速率和产物合成速率。因此，选择合适的发酵温度极其重要。毕赤酵母的最适生长温度是30 ℃，而诱导表达的温度则因外源蛋
白的不同存在差异，但一般都≤32 ℃，因为较高温度下外源蛋白表达量显著下降，细胞衰亡速率增加。不少研究者指出，低温更有利于诱导外源蛋白的合成。
2.2 pH
pH作为发酵过程中重要的化学参数，对发酵液的物理性质、细胞膜的电荷状态及参与细胞反应的酶活性等有重要影响，进而影响菌体的生长及目的蛋白质的表达。据研究报道，pH 在3.0～7.0的范围内毕赤酵母均可以正常生长，低于2.2时细胞生长会受到抑制[13]。但考虑到菌体细胞膜的性质， 以及毕赤酵母生长过程中产生的各种代谢产物会对后期诱导表达产生重要影响，因此，通常选择控制发酵pH在4.0～6.0范围内。目前，在毕赤酵母工程菌发酵生产过程中，一般采用通过流加氨水变调pH的方法来控制菌体的生长和目的产物的表达。大规模发酵使用BSM培养基时，细胞生长期的pH一般为5.0，因为超过该值时，培养基中无机盐离子易形成沉淀，对发酵产生不利影响。在分泌型蛋白表达过程中，选择合适的诱导pH能通过改善菌体内某些酶的活性，促进对营养物质的吸收及代谢，从而提高目的蛋白的表达量。
2.3 溶氧
毕赤酵母是一种强好氧微生物，在进行发酵培养时，菌体的快速增长伴随着耗氧量的增大，且菌体的生长期和产物表达期对氧的需求量往往不一致[15]。如果供氧不足，容易造成菌体生长受限，进而影响目的蛋白的表达。因此菌体生长期时，溶氧（dissolved oxygen，DO）一般控制在30%以上，而在诱导表达阶段维持在20%以上。另外，当流加补料过程中甘油浓度过高，而溶氧供应不足时，发酵液中往往会积累甘油厌氧发酵生成的乙醇、乳酸等副产物，会对发酵产生不利影响。因此，控制发酵过程中的溶氧水平对于高效表达外源蛋白至关重要。然而，溶氧水平过高也会对菌体生长和繁殖产生影响[17]。有研究发现，发酵液中高浓度的氧自由基会对细胞产生毒害作用。因此，针对不同的反应体系，需要控制溶氧浓度在适宜的范围内，才能保证外源蛋白的高效表达。
3. 补料策略
菌体生物量的积累是提高外源蛋白表达量的关键。当生长阶段培养基中碳源耗尽时可以通过流加补料方式补充甘油，使菌体再次生长到达更高生物量水平。这个阶段的补料碳源、补料速率、流加方式及时间等都是细胞增殖效率的影响因素。为了实现毕赤酵母高密度培养的工业化放大，不少研究者对补料方式做了深入研究。常用补料方式包括3种：间歇性流加补料、恒速流加补料以及指数流加补料。间歇性流加和恒速流加方式较为普遍，且操作简单，但往往不能很好的满足菌体生长需要。指数流加是根据菌体生长规律而建立的补料方式，这种方式能较好的保持补料速率与菌体需求的一致性，但对菌体生长速率的把握有一定难度。研究发现，当以较高的速率补充甘油能达到高细胞密度，但同时易积累过量的乙醇及乙酸盐从而造成活性蛋白的减产；当以较低的速率补充甘油时有利于产物表达量的提高，但却延长了过渡期，不利于工业化生产。因此，发酵过程中应合理把握细胞每个阶段的比生长速率，以此调整甘油的流加速率，提高底物利用率，为工业化生产提供指导。对细胞生长阶段碳源的添加策略进行优化， 是毕赤酵母高密度发酵优化中不可缺少的环节。其中，通过在线检测甘油浓度流加法是近年来发展起来的细胞生长阶段生物量监测方法。
二、 外源蛋白表达阶段优化
诱导型毕赤酵母表达外源蛋白的第一步即在培养基中添加甲醇，一方面添加的甲醇为菌体生长提供碳源；另一方面，甲醇在启动子AOX基因编码的醇氧化酶的催化下分解，调控表达目的蛋白。因此，在诱导期，调控甲醇诱导机制对提高外源蛋白表达量有重要影响。当甲醇浓度太低时，由于诱导剂的缺乏，蛋白表达量极低，且易被自身蛋白酶降解。传统的表达优化策略有以下缺点1) 高耗氧特性，通空气供氧、培养后期/诱导期的溶氧浓度 (DO) 无法控制；2) 如果追求高细胞浓度，在细胞培养后期乙醇会积累，导致外源蛋白生产表达的不稳定；3) 在较低温度 (20 ℃) 下诱导有利于外源蛋白的表达，可以增强 AOX 的活性，缓解目标蛋白的降解，但是低温诱导会增加热交换压力与氧气供应的负担/成本，特别是在夏季；4) 能量(NADH) 物质的无效生成可造成过多/无效的甲醇消耗，降低整个发酵性能。为了解决上述问题，人们提出了另一种在低细胞浓度下启动甲醇诱导的操作策略。Wang 等使用该策略表达碱性果胶酶，发现在低细胞浓度 56.7 g DCW/L 下启动甲醇诱导，蛋白生产效率 (Qv) 最大，比在细胞浓度 83.39 或 124.9 g DCW/L 启动诱导的 Qv 高11.6%和 18.4%。Jia 等报道指出，在低细胞浓度 60 g DCW/L 时启动诱导，同时将诱导温度控制在 22 ℃的较低水平，提高了聚乙烯醇)脱氢酶的产量，且 DO 一直处于可控范围 (5%–20%) 内。
诱导和培养时间同样是影响蛋白表达量的重要因素，应根据不同外源蛋白确定最优诱导和培养时间。另外，在表达含有金属的酶时，在培养基中添加一些 Ba2 + ， Mg2 + ， Cu2 + ， Fe3 + ， Zn2 + ， Co2 + 等金属离子也会提高蛋白表达水平。由此可见， 优化蛋白表达条件需从多方面综合考量， 必要时采用正交试验或响应面分析以简化繁琐的实验过程
三、 总结
由于现阶段毕赤酵母表达系统的分子生物学研究已比较透彻，因此，在表达系统构建成功的基础上，进一步优化发酵培养条件是提高外源蛋白表达量的有效手段。在发酵过程中，发酵条件的选择、工艺参数的确定以及诱导机制的建立都与外源蛋白的表达量有着密切关系。众多的研究结果表明，不同外源蛋白因分子量等性质的不同、结构的差异等，其发酵工艺参数与蛋白表达量的关系也不同，因此，根据表达蛋白自身性质的不同而建立相应发酵工艺体系对于深入研究外源蛋白性质与表达机制的关系有重要意义，也为探索新型外源蛋白在毕赤酵母中的表达提供指导。随着自动化控制技术、检测技术、计算机科学的发展，恒定速率补料、恒化培养成为可能，西尔曼科技有限公司利用甘油传感器结合在线取样系统可以使发酵过程中的甘油甲醇浓度控制在恒定的水平，以控制毕赤酵母的比生长速率使发酵的代谢途径朝着产物合成的方向进行。
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