袁伟‘.2*，柯涛‘’，杜敏华‘，褚学英‘，胡凡3，惠丰立‘
1南阳师范学院生命科学与技术学院，南阳473061
2河南师范大学生命科学学院，新乡453007
3湖北大学生命科学学院，武汉430062
摘要:凝乳酶在奶酪加工中应用广泛，为获得高活性的凝乳酶制剂，采用乳酸克鲁维酵母为宿主，首次对经密码子
优化的牛凝乳酶原基因进行表达利用。NAWorks3.0软件辅助设计，用两步PCR法合成了小牛凝乳酶原基因((GenBank
Accession No. AA30448)将该基因插入酵母表达载体pKLACl，构建了重组载体pKLAC 1-Prochy，并用电脉冲法将线
性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中通过含1%酪蛋白的YEPD平板活性筛选，PCR鉴定，最后获得了
一株多拷贝整合的基因工程菌chyl该菌株可分泌表达牛凝乳酶原，经SDS-PAGE分析，证明重组牛凝乳酶原的分
子量约为41 kDa，符合预期大小，酸化处理后为36 kDa，证明可以正确自我剪切液体培养%h后，酶活最高达到
99.67 SU/mL分别以半乳糖和葡萄糖为碳源的条件下表达，其酶活性差异不大，说明在发酵期间，可以不经过半乳糖
诱导即可产生高水平的牛凝乳酶原产物该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件，并为凝乳酶
的工业化生产莫定了基础
关键词:牛凝乳酶原，乳酸克鲁维酵母，基因合成，密码子优化
