l层析技术在 生物制药中的应用
l一. 离子交换层析技术
l定义：利用溶液中各种带电颗粒与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作称离子交换法。
l离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子组成。
l平衡离子带正电荷的为阳离子交换剂，平衡离子带负电荷的为阴离子交换剂，可见离子交换剂是一类具有活性基团的荷电固相颗粒。
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l离子交换层析技术
l离子交换层析技术
由于待分离的溶质分子带有不同性质的电荷和不同电荷量，因而在作为固定相的离子交换剂和流动相的洗脱液之间发生可逆交换作用，并通过调节pH值、或改变同性离子的浓度等方法，使溶质分子移动的速度发生变化，从而达到分离的目的。
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l 离子交换层析的应用
如庆大霉素，小诺霉素的提炼，应用了离子交换技术。
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l庆大霉素的提炼
l 酸化的目的在于将庆大霉素从菌丝体中释放出来，然后为了便于离子交换，将酸化液中和，再于中性溶液中投入732强酸性阳离子树脂。因为庆大霉素属于碱性抗生素，系有机碱，能与多种酸成盐，在水溶液中以离子状态G+存在，可以为阳离子树脂所吸附，对吸附了庆大霉素的732树脂进行洗涤，先用稀酸洗至无Ca2+、Mg2+，接着用无盐水洗至无Cl-，然后用稀氨洗去小组分杂质，最后用浓氨进行洗脱，洗脱液（解吸液）用711阴离子树脂进行脱色，然后经浓缩，转盐、活性炭脱色，喷雾干燥即得庆大霉素成品。
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l 离子交换层析的应用
粗卵蛋白的分级分离
l 卵蛋白中：主要有卵清蛋白54-57%（pI4.5)；蓝清蛋白12-15%（pI6.1)；卵粘蛋白3-4%(pI4.7)。
l 卵白过滤，用polybuffer74稀释，离心，上PBE94柱，以0.025mol/L咪唑-HCl (pH7.2)平衡，用1:10polybuffer74洗脱，分辨率良好。
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l二. 凝胶层析
l凝胶层析，是指样品混合物通过一定孔经的凝胶固定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的一种分离技术。
l因整个层析过程与过滤相似也称凝胶过滤。
l又由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，也称排阻层析。或称凝胶扩散层析。
l凝胶的每个颗粒的细微结构如同一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，大的分子被排阻于凝胶颗粒之外，因而也称分子筛层析。
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l凝胶层析分离原理
分子筛理论最容易理解，当含有大小分子的混合物品流给凝胶层析柱时，各组分随洗脱液的流动而移动. 大分子进入不了颗粒内部，最先流出；中分子部分地进入颗粒，流出速度中等；小分子进入所有颗粒内部，移动速度慢，最后流出。整个样品接分子量大小顺序先后流出层析柱，从而达到分离。
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l凝胶层析分离原理
l凝胶层析分离原理
l当将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵座标，即得下图的洗脱曲线。
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l凝胶层析的应用
l凝胶层析目的（或称分离形式）一般有二种：分组分离和分级分离。
l分组分离亦称类分离，其目的是将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐的分离,常用Sephadex G-25，因为其分离范围是1,000-5,000，被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧，大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。
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l凝胶层析的应用
l分级分离，将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白。
l对于这种分子量相近的物质的分离常常选用排阻限略大于样品中最高分子量的凝胶，即O≤Kd≤1。
l如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。
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l凝胶层析的应用
l脱盐
l浓缩
l去热原
l分子量测定
l纯化
l凝胶层析的应用:脱盐和浓缩
l脱盐和浓缩属类分离，选择凝胶使大分子组为全排阻，小分子组为全渗入（Kd=1）。
l脱盐用的凝胶多用大粒度的、高交联度的凝胶。
∵交联度大，凝胶颗粒的强度较好；
粒度大，柱层操作比较便利，流速也高。
l洗脱多为易挥发盐的缓冲溶液；
∵用水洗脱时，有些蛋白质脱盐后溶解度下降，造成被凝胶粒吸附甚至以沉淀状态析出。
l样品体积最好不大于内水体积的三分之一，以便得到理想的脱盐效果。
l凝胶层析的应用:脱盐和浓缩
方法：
l柱层析
l包埋法 样品置于透析袋中埋入干胶颗粒堆内，经过相当时间后，样品中的盐与水分一道为干胶所吸收。
l直接投入法 即将一定量的干胶投入盛样品容器或直接使样品溶液从干胶柱上流下。
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l凝胶层析的应用:分离纯化
用SephadexG-50纯化牛、猪胰岛素:
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l用SephadexG-25分离氨基酸混合物
l用SephadexG-25分离氨基酸混合物
l用葡聚糖凝胶分离多组分混合物，除利用分子筛效应外，还可利用某些物质与凝胶具有程度不等的弱吸附作用。如图7.31，用SephadexG-25分离氨基酸混合物，各个氨基酸流出的先后顺序并不是按分子量大小的顺序，而是按照吸附作用强弱的顺序，其中二个酸性氨基酸，谷氨酸（pI3.22），甘氨酸（pI5.97）先被流出，而pI分别为5.48和5.66的苯丙氨酸，酪氨酸，由于是苯环化合物，存在弱吸附故后被流出，而色氨酸是杂环合物，碱性氨基酸，吸附最强，所以最后流出.
l凝胶层析的应用
l分子量测定
l测定依据：不同分子量的物质，只要在凝胶的分离范围内（渗入限与排阻限之间），其洗脱体积Ve及分配系数Kd值随分子量增加而下降。
l待测物质洗脱体积与分子量关系符合下式： Ve=-KlogM+C
K、C 是常数，为直线方程的斜率和外推截距。
同时 Kav=-K′logM +C
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l凝胶层析的应用
l测定分子量方法：标准曲线法。
l先以3个以上的已知分子量的标准蛋白（有标准蛋白商品出售）过柱，测取各目Ve值，以Ve做纵坐标，logM 做横坐标制作标准曲线，之后在同一测定系统测取未知物质的Ve值，即可由标准曲线求得分子量。
l注意：测得的分子量是近似分子量，误差在±10%。
l该法操作简便，需要样品量较少，实用价值较大。
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l凝胶层析的应用:分子量测定
l三. 亲和层析
l人们发现生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的专一分子可逆结合的特性，
l例如 酶与底物、抗原与抗体、激素与受体、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸，多糖与蛋白复合体等，都具有这种特性。
l 生物分子间的这种结合能力称为亲和力，根据生物分子特异亲和力而设计的层析技术称为亲和层析，在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层析介质称为载体。
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l亲和层析的设计原理和过程:
l3.亲和层析的应用
l由于亲和层析技术具有简便，快速、专一和高效等特点，应用十分广泛，已普及到生命科学的各个领域。
l应用范围如下：
（1）提取、分离纯化、浓缩各类生物分子；
（2）分离纯化各种功能细胞，细胞器，膜片段和病毒颗粒；
（3）用于各种生化成分的分析检测；
（4）其他；
l3.亲和层析的应用
l最大优点：利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质。
l 例如分离胰岛素受体时，把胰岛素作为配基，偶联于琼脂载体上，经亲和层析，从肝脏匀浆中提取胰岛素受体，纯化达8000倍。
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l金属螯合亲和层析
l原理：蛋白质分子能够与金属离子发生亲和反应，并与之结合，可用于吸附纯化蛋白质。蛋白质表面的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基团、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基团，可提供电子，与金属离子结合，从而发生亲和层析。配基与生物大分子的结合机理包括范德华力、疏水键、静电以及金属螯合作用。
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l金属螯合亲和层析柱的制备：
将环氧活化型Sepharose 6B与金属螯合剂（如亚氨二醋酸）偶联成配基，再用金属离子溶液处理（如Zn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Cd2+），即成。
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l金属螯合亲和层析
l上样：柱子经平衡后，可将含有生物活性物质的样品上柱，与固定化的金属配基复合物有亲和力的分子都将被滞留，其余则流出柱外。
l 洗脱：可通过改变盐的浓度、改变pH、或由竞争性的试剂将蛋白质置换下来，这些方式的机理都是通过降低固定化金属离子和蛋白质之间的亲和常数。
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l金属螯合亲和层析的应用:
利用含汞树脂分离谷胱甘肽
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l 谷胱甘肽中的半胱氨酸含有巯基，巯基化合物与汞具有很强的化学亲和作用，因此用含汞树脂提取含巯基化合物能取得很好的效果。
l谷胱甘肽多从酵母中提取，也可从啤酒生产的废酵母中提取。酵母的提取液中除了含谷胱甘肽外，还含有其他含巯基的氨基酸和短肽，含汞树脂对这些物质也有一定的吸附。可通过调节酵母提取液的pH值，改变树脂对各种杂质成分的吸附力，以达到分离的目的。
l有机染料亲和层析
l基本原理：一些有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似于NAD+的结构，因此一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料有一定的亲和力，如果这些染料作为配基共价偶联到纤维素或琼脂糖等多糖载体上，就能制得染料亲和层析柱。常用的有机染料有二羟偶氮复合物。
l有机染料亲和层析已成功地分离纯化了多种酶，以及应用于白蛋白、脂蛋白和干扰素等的分离。
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l有机染料亲和层析应用：
苯丙氨酸脱氢酶的纯化
苯丙氨酸脱氢酶的纯化应用了有机染料亲和层析法。将一种模拟生物的染料配基（商品名：Procion Red HE-3B）,结合在Sepharose CL-4B上。Procion Red HE-3B与依靠NAD/NADH作辅酶的酶有特异性的结合，因而在分离这种类型的酶时，应用很广。
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l有机染料亲和层析应用：
苯丙氨酸脱氢酶的纯化
l将含有苯丙氨酸脱氢酶的酶提取液上柱，亲和柱专一性地吸附苯丙氨酸脱氢酶。然后，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，再用1mmol/L的 NADH（配于平衡缓冲液中）将酶洗脱下来。经过这种方法纯化的酶，纯度达到单一区带，达到了诊断用酶制剂的纯度要求。
l苯丙氨酸脱氢酶可作为诊断试剂，用于测定和监测遗传性代谢疾病苯丙酮酸尿。作为诊断用酶制剂的市场很大。
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l四.膜分离技术
l膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。
l透析技术
l透析技术
l优点：简便，不需要复杂装置。
l缺点：速度慢、处理量小。
l用途：
（1）透析法多用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐；
（2）常用来对溶液中小分子成分进行缓慢的改变。即所谓的透析平衡，如浓缩大分子、透析结晶等。
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l平面透析器
用塑料框把透析管张开成为很薄的平面透析管，使透析面积增大，提高了效率。
l 浅流透析器
可兼用于透析和超滤。
l超滤技术
l超滤技术是近几十年迅速发展起来的一项分子级薄膜分离手段，它以特殊的超滤膜为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力将不同分子量的物质进行选择性分离。
l 超滤膜的最小截留分子量为500道尔顿，在生物制药中可用来分离蛋白质、酶、核酸、多糖、多肽、抗生素、病毒等。
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l超滤技术
l优点：没有相转移，无需添加任何化学物质，可以在低温下操作，过滤速度较快，便于做无菌处理，分离操作简便，避免生物活性物质的活力损失和变性。
l用途：①大分子物质的脱盐和浓缩；
②小分子物质的纯化；
③大分子物质的分级分离；
④生化制剂或其他制剂的去热原处理。
l超滤技术的应用
l浓缩和脱盐
优点是不消耗试剂，无相转移，可在低温下进行，浓缩的同时还可脱掉盐和其他小分子杂质。
l脱盐方法：
（1）稀释超滤法
盐离子等小分子杂质随溶剂（水）不断透过滤膜而去，当浓缩到一定浓度时再加入溶剂至原体积，如此反复多次，绝大部分小分子物质可被除去。
（2）渗滤法脱盐 原理与稀释法相同。
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l 超滤的应用
l分级分离与纯化
如右图所示，按分子量截留值由大而小串联几个超滤器，各自保持一定体积，用10-20倍体积的缓冲液逐级洗下，不同分子量物质相应下移，在各滤器中获得不同分子量范围的组分，从而使大分子量得到分离和纯化，同时也进行了浓缩。
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l超滤的应用
l除菌 超滤是一种很好的冷灭菌法，适合于不能高压消毒灭菌的生化产品；
l去热原 适合一些分子量较小的生物药物的去热原；
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l超滤的应用
l超滤与酶反应器联用
l使分解产物生成后立即与底物分离，提高底物利用率，减少酶用量，提高酶促反应速度。
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l微孔膜过滤
l微孔膜过滤又称“精密过滤”，是最近20多年发展起来的一种薄膜过滤技术。
l主要用于分离亚微米级颗粒，是目前应用最广泛的一种分离分析微细颗粒和超净除菌的手段。
l优点：（1）设备简单；
（2）操作简便、快速；
（3）分离效率高，重现性好；
（4）一些微孔滤膜具有结合生物大分子的特殊能力。
l微孔滤膜过滤的应用
l 药液中微粒及细菌的滤除
静脉注射若受微粒及细菌的污染，对人体危害性很大。
微孔滤膜过滤在制药工业中对于滤除药液中微粒、微生物和检测药液的质量是不可缺少的保证手段。
l抗生素的无菌检验
l空气净化处理
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l微孔滤膜过滤的应用
抗生素的无菌检验
l用微孔膜过滤进行无菌检验比常规法（直接接种法）采样容量大、简便、快速、灵敏度高，并可避免抗生素本身的抑菌作用。
l方法: 取样，加无菌生盐稀释，置于已灭菌的滤膜、滤器上，抽滤。抽滤完毕后，将滤膜置于盛培养基的培养皿中培养，一定时间后，观察滤膜上的菌落生长情况。（培养基分需气菌、厌气菌培养基）
l药典收载的二个方法：
(1)直接接种法
用青霉素酶加入抗生素样品中，消除抗生素的抗菌。
(2)薄膜过滤法
分别进行阳性对比、阴性对比试验。
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祝大家国庆节快乐!
再见!
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