李检秀
1, 2 ，陈先锐 1 ，陈小玲 1 ，黄艳燕 1 ，莫棋文 1 ，谢能中 1, 2 *，
黄日波
1, 2 *
（1．广西科学院，非粮生物质酶解国家重点实验室，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，广西生物炼制重点实验室，广西
南宁 530007；2．广西大学生命科学与技术学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004）
摘要 目的：在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶（DAR），同时构建辅酶 NADH 原位再生系统，利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成( S )-乙偶姻。方法：PCR 克隆多粘芽孢杆菌（ Paenibacilluspolymyxa ） dar 基因，连到质粒 pETDuet-1，转化至大肠杆菌（ Escherichiacoli ）BL21(DE3)，构建重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR；通过 HiTrap TALON 柱亲和层析纯化表达产物 DAR 酶蛋白，测定 DAR 的比酶活和分子动力学参数。在重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR 中构建辅酶 NADH 原位再生系统，协同表达枯草芽孢杆菌（ Bacillussubtilis ）的葡萄糖脱氢酶（GDH），构建重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH，并以此重组菌为全细胞生物催化剂，优化催化条件，提高( S )-乙偶姻的产量和产率。结果：获得重组工程菌 E.coli BL21(DE3)-DAR 和 E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR 以 NADH 为辅酶还原丁二酮的米氏常数 K m 、最大催化速率 V max 、催化常数 K cat 分别为 2.59 mM，1.64 μmol/L∙min∙mg，12.3/s，还原丁二酮生成( S )-乙偶姻光学的纯度为 95.86 %，具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶 NADH 原位再生系统后，重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH 可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料，乙偶姻产量达 51.26 g/L，转化率 81.37 %，生产速率 5.13 g/(L∙h)。结论：使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物( S )-乙偶姻，以重组菌为全细胞生物催化剂合成( S )-乙偶姻，不需额外添加昂贵的辅酶，具有较高的生产应用价值。
摘要 目的：在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶（DAR），同时构建辅酶 NADH 原位再生系统，利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成( S )-乙偶姻。方法：PCR 克隆多粘芽孢杆菌（ Paenibacilluspolymyxa ） dar 基因，连到质粒 pETDuet-1，转化至大肠杆菌（ Escherichiacoli ）BL21(DE3)，构建重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR；通过 HiTrap TALON 柱亲和层析纯化表达产物 DAR 酶蛋白，测定 DAR 的比酶活和分子动力学参数。在重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR 中构建辅酶 NADH 原位再生系统，协同表达枯草芽孢杆菌（ Bacillussubtilis ）的葡萄糖脱氢酶（GDH），构建重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH，并以此重组菌为全细胞生物催化剂，优化催化条件，提高( S )-乙偶姻的产量和产率。结果：获得重组工程菌 E.coli BL21(DE3)-DAR 和 E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR 以 NADH 为辅酶还原丁二酮的米氏常数 K m 、最大催化速率 V max 、催化常数 K cat 分别为 2.59 mM，1.64 μmol/L∙min∙mg，12.3/s，还原丁二酮生成( S )-乙偶姻光学的纯度为 95.86 %，具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶 NADH 原位再生系统后，重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH 可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料，乙偶姻产量达 51.26 g/L，转化率 81.37 %，生产速率 5.13 g/(L∙h)。结论：使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物( S )-乙偶姻，以重组菌为全细胞生物催化剂合成( S )-乙偶姻，不需额外添加昂贵的辅酶，具有较高的生产应用价值。
关键词：全细胞生物催化剂; 辅酶再生系统; 丁二酮还原酶; 乙偶姻
