代谢工程改造大肠杆菌合成丁二酸及发酵罐放大工艺

姚伶俐1 潘海峰2 田文娟2 惠天聪2 谢志鹏1,2* 张建国2

(1. 浙江大学药物生物技术研究所 浙江 杭州 310058)

(2. 杭州宝晶生物股份有限公司 浙江 杭州 311106)

摘 要：
【背景】Escherichia coli AFP111 发酵生产丁二酸时大量副产乙酸，丁二酸得率低。
【目的】代谢工程改造Escherichia coli AFP111，提高丁二酸得率，降低副产物乙酸的生成，建立100 L 规模的丁二酸发酵工艺。【方法】一步同源重组敲除乙酸合成途径关键酶基因，改造丁二酸合成途径关键酶启动子实现过表达；单因素优化5 L 发酵罐培养条件。【结果】敲除乙酸产生途径编码乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的基因ackA-pta、苏氨酸脱羧酶和2-酮丁酸甲酸裂解酶的基因tdcDE获得SX02 菌株，摇瓶发酵条件下其乙酸产量下降了53.42%，丁二酸得率提高9.85%。

在SX02 菌株基础上，经启动子改造过表达编码葡萄糖激酶的基因glk 后获得菌株SX03，其Glk 酶活性提高3.66 倍，乙酸产量下降了31.62%，丁二酸得率提高8.28%。SX03 菌株发酵生产丁二酸在5 L 发酵罐进行放大，其乙酸产量为3.97 g/L，丁二酸得率为1.62 mol/mol 葡萄糖，相比出发菌株的乙酸产量下降了75.76%，丁二酸得率提高19.12%。在5 L 发酵罐上对比研究和葡萄糖浓度，获得如下最适发酵条件：pH 6.8，搅拌转速250 r/min，葡萄糖100 g/L，发酵结束时乙酸产量为2.24 g/L，丁二酸得率为1.66 mol/mol 葡萄糖。中和剂替换优化后乙酸产量下降了20.65%，丁二酸得率提高2.47%。菌株SX03 发酵工艺进一步在100 L 发酵罐上实现放大，其乙酸产量为1.91 g/L，丁二酸得率为1.30 mol/mol 葡萄糖。
【结论】通过代谢工程改造的大肠杆菌，其副产物乙酸含量显著下降，丁二酸得率提高，并在5 L 和100 L 发酵罐上实现了工艺放大，展现出较大的工业化利用潜力。

关键词：大肠杆菌，丁二酸，乙酸，葡萄糖激酶，工艺优化，中试发酵