李利宏，张荣珍*，周丽仙，柳志永，旋凯昂，饶俊超，徐岩
江南大学生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡 214122
摘要：
【目的】从Pseudomonas putida KT2440 基因组中，钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(ltaE)，构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质，和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。
【方法】以P. putida KT2440 基因组DNA 为模板，PCR 扩增出ltaE 基因，构建重组表达质粒pET28a-KT2440 并转化Escherichia coli BL21 (DE3)，获得重组菌E. coli BL21 (DE3)/pET-KT2440，利用Ni2+柱亲和层析纯化低特异性L-苏氨酸醛缩酶(LTA)，对关键氨基酸位点Thr206 和Lys207 实施定点突变。
【结果】SDS-PAGE 结果表明LTA 在大肠杆菌中获得高效表达，分子量为40 kDa 左右，与理论值大小相符。
【目的】从Pseudomonas putida KT2440 基因组中，钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(ltaE)，构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质，和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。
【方法】以P. putida KT2440 基因组DNA 为模板，PCR 扩增出ltaE 基因，构建重组表达质粒pET28a-KT2440 并转化Escherichia coli BL21 (DE3)，获得重组菌E. coli BL21 (DE3)/pET-KT2440，利用Ni2+柱亲和层析纯化低特异性L-苏氨酸醛缩酶(LTA)，对关键氨基酸位点Thr206 和Lys207 实施定点突变。
【结果】SDS-PAGE 结果表明LTA 在大肠杆菌中获得高效表达，分子量为40 kDa 左右，与理论值大小相符。
Ni2+柱亲和层析纯化LTA，获得单一条带。利用双酶耦联法测得LTA 酶活为5577.3 U/mg，最适反应温度为50 °C，最适pH 为8.0。在温度低于45 °C，pH 5.0−9.0 时，重组酶较稳定。LTA 酶的Km 和kcat值为23.95 mmol/L 和19216.6 s–1。Mg2+、Ca2+金属离子对LTA 有明显的促进作用，而Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等对酶有明显的抑制作用。该酶在叔丁基甲基醚溶剂中具有良好的耐受性，在叔丁基甲基醚中保存1 h 后仍保留90%以上的酶活。Thr206Ser 突变明显提高了酶对温度的稳定性。Lys207 对酶催化功能是必需的，该位点突变对酶活都是致死的。
【结论】克隆并表达P. putida KT2440 的LTA 酶，研究了酶学性质，通过定点改造提高了酶的温度稳定性，筛选获得一种酶耐受性好的有机溶剂，为LTA 酶在有机溶剂中高效稳定催化β-羟基-α-氨基酸奠定了较坚实的研究基础。
【结论】克隆并表达P. putida KT2440 的LTA 酶，研究了酶学性质，通过定点改造提高了酶的温度稳定性，筛选获得一种酶耐受性好的有机溶剂，为LTA 酶在有机溶剂中高效稳定催化β-羟基-α-氨基酸奠定了较坚实的研究基础。
关键词：恶臭假单胞菌，低特异性L-苏氨酸醛缩酶，酶学性质，致死突变，温度稳定性
