构建重组枯草芽孢杆菌催化制备 D-对羟基苯甘氨酸

李法彬 刘 露 杜 燕 班 睿

（天津大学化工学院 天津大学系统生物工程教育部重点实验室 天津 300350）

摘要 

目的：在 Bacillussubtilis中表达异源 D海因酶基因（hyd）和 D氨甲酰水解酶基因（adc），构建重组细胞作为催化剂，用于生产 D对羟基苯甘氨酸（DHPG）。

方法：构建 hyd表达质粒，考察培养基中二价金属离子对 D海因酶活性的影响。过表达 acoR基因，考察 AcoR蛋白胞内水平与PacoAhyd基因拷贝数的关系。筛选表达 adc基因的启动子，构建 hyd和 adc基因共表达质粒，考察双酶活性菌株的催化特性。

结果：成功构建了海因酶表达质粒 pHPS和 pUBS，培养基中添加0.8mmol／L的 MnCl2·4H2O，使 168N／pUBS菌株的 D海因酶活性达到 956U／gDCW。整合表达PcddacoR基因，使 LSL02／pUBS菌株的 D海因酶活性达到 1470U／gDCW。单拷贝 PAEadc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒 pUBSC被成功构建，菌株 LSL02／pUBSC的最适催化温度为40C ～45C，催化活性能够持续 12h，当底物起始浓度为 20g／L时，反应 12h生成的 DHPG达到14.32g／L，转化率达到 95%，收率超过 80%。

结论：构建具有 D海因酶和 D氨甲酰水解酶双酶活性的重组 Bacillussubtilis作为全细胞催化剂，用于海因酶法生产 DHPG，具有技术上的可行性和优势。

关键词 枯草芽孢杆菌 D-海因酶 D-氨甲酰水解酶 表达质粒 D-对羟基苯甘氨酸