大肠杆菌也是目前常用的细胞加工厂，在用于表达外源蛋白的各种表达系统中大肠杆菌
因繁殖迅速、操作简便、成本低廉而得到广泛应用。但其属于原核表达系统，在表达外源基
因时缺乏对真核生物蛋白质的复性功能和修饰加工系统，导致外源蛋白复性困难，不能形成
正确的空间构象，从而影响蛋白功能。因此在目前已发表的类溶菌酶蛋白相关研究工作中，
大肠杆菌主要用于表达蛋白进行抗体制备，而在对类溶菌酶蛋白进行功能研究时，则主要采
用毕赤酵母表达系统。
毕赤酵母可对外源蛋白进行适当的糖基化，对于表达需要正确形成天然结构或在胞内不
稳定的蛋白以及有毒蛋白有着明显的优势;在适当的条件下，外源蛋白通过毕赤酵母表达系
统可获得较高表达量，这些优势使毕赤酵母成为表达类溶菌酶蛋白的理想选择随着基因工程
技术的成熟，通过重组技术表达外源蛋白已获得成功。在医药蛋白领域，已有胰岛素、乙肝
表面抗原、人血清白蛋白、表皮生长因子等多种蛋白使用毕赤酵母表达实现商品化制备。在
工业酶制剂领域，也有许多酶制剂包括植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等利用毕赤
酵母实现了产业化规模的生产。
一、毕赤酵母表达系统研究进展
回顾毕赤酵母表达系统20多年的发展，从总体上决定毕赤酵母蛋白表达水平的因素主要
有两个:1)基因剂量，即外源基因的拷贝数;2}蛋白质的分泌。毕赤酵母系统开发前期，
集中解决的是基因剂量的问题，近10年研究的热点是蛋白分泌的问题。以下将就这两方面进
行简要的阐述。
1基因剂量
与大肠杆菌和酿酒酵母等宿主不同，毕赤酵母自身没有稳定存在的游离型载体，所有的表达
载体都要整合到酵母的基因组上。虽然有PAOX1, PGAP等强启动子，但由于整体上拷贝数较
低，外源表达量不足。因此，早期的研究为了提高蛋白表达水平，主要是通过构建和筛选载
体发生多次整合的多拷贝菌株来提高外源蛋白的产量。为了得到多拷贝菌株，人们设计了体
外法和体内法两种策略。体外法是在体外构建多拷贝载体，再将其转化至酵母宿主中。该方
法优点是多拷贝转化子筛选到的几率较高，但缺点是分子克隆工作量大，由于载体大小的限
制，一般最多可获得6一8个拷贝的载体。体内法是通过在载体上加入抗生素标记，如Zeocin,
6418抗性基因等，将载体转化入宿主之后，可以通过提高培养基中抗生素浓度筛选多次整
合的多拷贝转化子。该方法的优点是构建较为简单，缺点是筛选工作量较大、假阳性比率较
高、拷贝数鉴定较为麻烦。
2蛋白质分泌
人们在研究拷贝数时，发现拷贝数提高到一定程度，蛋白表达量并不是线性增加的，甚至有
可能不变或降低。许多研究发现，当将这些宿主细胞破碎后，有相当大比例的新合成蛋白积
累在细胞内无法分泌出来。因此，研究者逐渐意识到蛋白表达在分泌步骤上很易受到限制。
与基因剂量问题不同，分泌问题是一个表达系统分泌表达的共性问题，不仅限于毕赤酵母系
统，而且分泌问题比拷贝数问题复杂的多，分泌过程包括蛋白的折叠、修饰、运输、修复以
及降解等多个步骤，涉及基因多达上千个。当外源蛋白过量表达时，大量新合成的多肤需要
折叠和修饰，这就会占用大量宿主细胞分泌途径中的蛋白伴侣等辅助因子，使得细胞对于外
源蛋白的加工能力很快趋于饱和，结果有相当比例的重组蛋白因缺乏足够的伴侣因子而无法
折叠成正确构象，这些未折叠或错误折叠的蛋白将无法通过细胞自身的蛋白质质检系统，因
而或被保留在内质网中继续折叠，或被运转到细胞质中降解。为了解决分泌的限制，提高蛋
白质的分泌表达水平，前人进行了大量的研究和尝试，主要工作可分为理性改造和反向工程
两个思路。
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