摘要：
【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+ )在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞 生命周期中具有重要的作用，其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略，获得高产 NAD+ 菌株，对于 NAD+ 依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。
【方法】首先通过内源性调节，对代谢途径中的关键酶基因进行强化，过量表达和共表达 NAD+ 合成途 径中的关键酶基因 pncB、nadD 和 nadE；其次，通过外源调节增加 NAD+ 前体物，优化诱导条件提高发 酵过程中关键酶的表达量，增加 NAD+ 的合成量；最后在单因素优化试验的基础上，以 NAD+ 含量为响 应值，采用 Box-Bohnken 试验设计方法，研究 3 个显著性影响因素相互作用对 NAD+ 积累量的影响，确 定最佳的优化条件。
【结果】根据关键酶基因强化策略，构建了 7 株重组菌，其中重组菌 E. coli BL21/pET-21a-nadE-pncB 胞内 NAD+ 含量相比初始菌株 E. coli BL21/pET-21a 提高了 405.2%。通过对该 菌株诱导条件和 NAD+ 合成前体的优化，使用 Design Expert 8.0 分析实验数据，得出该重组菌株的最佳 发酵条件为：诱导温度控制在 15–20 o C，OD600 为 0.6–0.8 时添加 IPTG 0.63 mmol/L、烟酸 15.8 mg/L、 诱导时长控制在 24 h。NAD+ 含量在最优条件下实验验证值可达 43.16 μmol/g DCW，与优化前相比提高 了 123.6%，与初始菌株相比提高了 1029.8%。
【结论】在大肠杆菌中共表达关键酶基因 pncB 和 nadE， 胞内 NAD+ 合成量明显增加，前体物以及诱导条件的外源调节使 NAD+ 积累量达到最佳优化值。实现了 提高 NAD+ 含量的目标，胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。 关键词：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，大肠杆菌，pncB，nadD，nadE，NAD+ 前体物质，发酵优化
