李阳 1,2 赵丽婷 2 顾正华2 李由然2 石贵阳1,2 丁重阳*1,2
1 糖化学与生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院 江苏 无锡 214122
2 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏 无锡 214122
摘要：
【背景】灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)是一种具有多种生物活性的大分子物质，已有研究者通过发酵调控优化或菌种改良使灵芝多糖产量得到一定的提高。但由于灵芝多糖糖供体合成途径并未完全明晰，其中关键酶特性解析也不完善，使得灵芝多糖产量的大幅度提高仍存在瓶颈。
【目的】通过异源表达大量制备灵芝中含量较少的磷酸葡萄糖变位酶(Phosphoglucomutase，PGM)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase ，UGPG)和磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannose isomerase，PMI)，并分别探究和比较其酶学性质，深入了解灵芝多糖的糖供体合成途径中关键酶的特性信息，为灵芝多糖合成发酵策略的高效制定提供依据。
【方法】以灵芝菌株CGMCC5.26 的cDNA 为模板，克隆得到关键酶基因gl-pgm、gl-ugpg 和gl-pmi，分别在E. coli BL21(DE3)中诱导表达，产物通过Co-NTA 树脂纯化后进行酶学性质研究。
【结果】纯化酶GLpgm、GLugpg 和GLpmi 均在E. coli 中实现大量表达。GLpgm 的最适反应pH 为8.5，GLugpg 和GLpmi 的最适pH同为7.5；GLpgm、GLugpg 和GLpmi 最适反应温度依次为35、40 和30 °C；1 mmol/L 的Ag+和Cu2+对3 种酶均具有强烈抑制作用，Mn2+、Mg2+对GLpgm 和GLpmi 均有激活作用，其中Mn2+对GLpgm 的激活作用高达2.7 倍。GLpgm、GLugpg 和GLpmi 的kcat/Km 值分别为196.08、818.60 和1 105.22 mmol/(L·s)。
【结论】在最适反应pH、温度及金属离子作用方面，GLpgm、GLugpg 和GLpmi与植物及真菌来源的这3 种酶较为相似，对底物的催化效率相对其他来源的酶高，为基于灵芝多糖合成途径的调控提供了更完善的信息。
【背景】灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)是一种具有多种生物活性的大分子物质，已有研究者通过发酵调控优化或菌种改良使灵芝多糖产量得到一定的提高。但由于灵芝多糖糖供体合成途径并未完全明晰，其中关键酶特性解析也不完善，使得灵芝多糖产量的大幅度提高仍存在瓶颈。
【目的】通过异源表达大量制备灵芝中含量较少的磷酸葡萄糖变位酶(Phosphoglucomutase，PGM)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase ，UGPG)和磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannose isomerase，PMI)，并分别探究和比较其酶学性质，深入了解灵芝多糖的糖供体合成途径中关键酶的特性信息，为灵芝多糖合成发酵策略的高效制定提供依据。
【方法】以灵芝菌株CGMCC5.26 的cDNA 为模板，克隆得到关键酶基因gl-pgm、gl-ugpg 和gl-pmi，分别在E. coli BL21(DE3)中诱导表达，产物通过Co-NTA 树脂纯化后进行酶学性质研究。
【结果】纯化酶GLpgm、GLugpg 和GLpmi 均在E. coli 中实现大量表达。GLpgm 的最适反应pH 为8.5，GLugpg 和GLpmi 的最适pH同为7.5；GLpgm、GLugpg 和GLpmi 最适反应温度依次为35、40 和30 °C；1 mmol/L 的Ag+和Cu2+对3 种酶均具有强烈抑制作用，Mn2+、Mg2+对GLpgm 和GLpmi 均有激活作用，其中Mn2+对GLpgm 的激活作用高达2.7 倍。GLpgm、GLugpg 和GLpmi 的kcat/Km 值分别为196.08、818.60 和1 105.22 mmol/(L·s)。
【结论】在最适反应pH、温度及金属离子作用方面，GLpgm、GLugpg 和GLpmi与植物及真菌来源的这3 种酶较为相似，对底物的催化效率相对其他来源的酶高，为基于灵芝多糖合成途径的调控提供了更完善的信息。
关键词：磷酸葡萄糖变位酶，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，磷酸甘露糖异构酶，异源表达，酶学性质
