施慧，穆晓清*，杨兴龙，战绍斌，田荣臻，聂尧，徐岩
工业生物技术教育部重点实验室，江南大学酿酒科学与酶技术中心，江苏无锡 214122
摘要：
【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞
【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞
生命周期中具有重要的作用，其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略，获得高产
NAD+菌株，对于NAD+依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。
【方法】首先通过内源性调节，对代谢途径中的关键酶基因进行强化，过量表达和共表达NAD+合成途
径中的关键酶基因pncB、nadD 和nadE；其次，通过外源调节增加NAD+前体物，优化诱导条件提高发
酵过程中关键酶的表达量，增加NAD+的合成量；最后在单因素优化试验的基础上，以NAD+含量为响
应值，采用Box-Bohnken 试验设计方法，研究3 个显著性影响因素相互作用对NAD+积累量的影响，确
定最佳的优化条件。
【结果】根据关键酶基因强化策略，构建了7 株重组菌，其中重组菌E. coli
【结果】根据关键酶基因强化策略，构建了7 株重组菌，其中重组菌E. coli
BL21/pET-21a-nadE-pncB 胞内NAD+含量相比初始菌株E. coli BL21/pET-21a 提高了405.2%。通过对该
菌株诱导条件和NAD+合成前体的优化，使用Design Expert 8.0 分析实验数据，得出该重组菌株的最佳
发酵条件为：诱导温度控制在15–20 oC，OD600 为0.6–0.8 时添加IPTG 0.63 mmol/L、烟酸15.8 mg/L、
诱导时长控制在24 h。NAD+含量在最优条件下实验验证值可达43.16 μmol/g DCW，与优化前相比提高
了123.6%，与初始菌株相比提高了1029.8%。
【结论】在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncB 和nadE，
【结论】在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncB 和nadE，
胞内NAD+合成量明显增加，前体物以及诱导条件的外源调节使NAD+积累量达到最佳优化值。实现了
提高NAD+含量的目标，胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。
关键词：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，大肠杆菌，pncB，nadD，nadE，NAD+前体物质，发酵优化
