【摘要】 乳酸链球菌素是一种由乳链球菌产生的细菌素，作为一种天然生物防腐剂，由于高效性和无毒性使其广泛应用于食品及医药工业中。本文从其分子结构、抑菌机制、分离提纯方法、应用等方面加以阐述，并对其发展前景进行了介绍。
【关键词】 乳酸链球菌素 研究 进展
乳酸链球菌素（Nisin）又称乳酸链菌肽或尼生素，是某些乳酸链球菌菌株代谢产生的一种小分子抗菌肽，它对许多包括金黄色葡萄球菌、溶血球菌、肉毒梭菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、李斯特菌在内的多种革兰氏阳性食物腐败菌和病原菌都有强烈的抑杀作用。目前，我国食品添加剂标准化委员会批准使用的微生物防腐剂只有Nisin和纳他霉素。1990年，我国将其列为国标GB2760-86品种，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品生产中。Nisin对热稳定，使用后在消化道内很快被蛋白水解酶消化成氨基酸，不会产生抗性和过敏反应，其作为一种理想的天然防腐剂已获得越来越广泛的应用。
1.Nisin的分子结构
乳酸链球菌素的分子式为C143H288N42O37S7，含有34个氨基酸残基，相对分子量为3510道尔顿，前体分子含有57个氨基酸残基，其中23个残基位于引导区，34个位于结构区。其活性分子常以二聚体和四聚体的形式出现，相对分子量为7000道尔顿和14000道尔顿。Nisin的结构中含有5个硫醚键形成的分子内环，其中一个是Ala-S-Ala，称为羊毛硫氨酸（Lan），其他4个是Abu-S-Ala，称为甲基羊毛硫氨酸（Melan）。在第5位和第33位残基各有一个脱氢丙氨酸（Dha），第2位残基有一个分甲基脱氢丙氨酸（Dhb）。天然Nisin主要有NisinA和NisinZ形式存在。NisinA和Z差别在于氨基酸顺序中的第27位氨基酸不同，在NisinA中是组氨酸，NisinZ中是天冬氨酸。Buchman等人克隆和测定了NisinA结构基因DNA序列以后，发现成熟分子中的脱氢丙氨酸、β-甲基脱氢丙氨酸、羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸是经翻译后修饰产生的。这种翻译后修饰作用涉及丝氨酸脱水成脱氢丙氨酸和苏氨酸脱水成β-甲基脱氢丙氨酸，然后半胱氨酸的巯基侧链与脱氢丙氨酸和β-甲基脱氢丙氨酸反应，生成含有硫醚环结构的羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸。
2. Nisin的抑菌机制
Nisin的抑菌作用就像一个阳离子表面活性剂。它对革兰氏阳性菌的营养细胞和孢子都有作用，而且作用于孢子的活性要大于对活性细胞的作用。其对营养细胞的主要作用点是细胞膜，抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，从而使细胞壁膜和磷脂化合物的合成受阻，并造成细胞内溶物（如钾离子、氢离子、氨基酸、核苷酸等物质）外泄，破坏细胞能量代谢，导致代谢中重要物质中间代谢产物的缺乏，并对DNA、RNA、蛋白质和多糖等物质的生物合成产生抑制作用，引起细胞裂解。对芽孢的作用是在孢子出现膨胀的起始阶段抑制其发芽，导致孢子不能存活。有研究认为，Nisin单体中的脱氢并氨酸（Dha）和甲基脱氢并氨酸（Dhb）可以与敏感细胞膜中的某些酶的巯基发生作用，因此认为Nisin作用机制与脱水氨基酸有一定关系。从分子动力学角度上说，是Nisin作用于靶细胞后，通过细胞膜上形成孔道产生抑菌作用。孔道形成使维持生命必须的离子梯度、质子动力耗散，并导致细胞死亡。Nisin可以通过两种方式形成孔洞，一种是Nisin在微摩尔级浓度下形成无靶目标（即无lipidⅡ）介导的孔道；另一种是Nisin在纳摩尔级浓度下通过细菌细胞膜上的lipidⅡ的介导形成孔道，同时Nisin与lipidⅡ的结合抑制肽聚糖的生物合成。另外，Nisin对敏感菌的净菌程度还取决于培养基的缓冲性、抑菌物的浓度、指示菌种类以及Nisin的添加浓度。
3.Nisin的提取方法
3.1 Nisin产生菌的筛选
Nisin产生菌最早是从发酵的牛奶中分离出来，随后在各种乳制品、一些植物材料和河水中发现了 Nisin的产生菌。在筛选菌株过程中，可以根据编码乳酸链球菌肽前体的结构基因与乳酸链球菌肽抗性基因和蔗糖发酵基因紧密连锁的原理，在添加Nisin、蔗糖以及溴甲酚紫的选择培养基上从牛乳中定向筛选乳酸链球菌素产生菌。而且，这种编码Nisin前体的基因位于一个可接合转移的转位子上，与Nisin抗性基因和蔗糖发酵基因紧密连锁。有研究表明，不同的乳酸抗性菌对Nisin产生的抗性是不同的，在Nisin产生菌中，该抗性由位于基因簇上的4个基因共同决定,即NisIFEG，它们分别编码细菌脂蛋白、ATP活性蛋白和膜蛋白，共同参与Nisin的免疫性。而不产生Nisin的菌中，该抗体由nsr基因单独决定，所以具有Nisin抗性的菌不一定能分离筛选出乳酸链球菌肽，而能发酵蔗糖产酸的乳酸乳球菌也都能够在筛选平板上生长，所以，对Nisin产生菌需要进行进一步的鉴定。
3.2 Nisin的分离纯化
3.2.1有机溶剂法 该法是利用正丙醇和氯化钠混合物从发酵液中回收Nisin，包括正丙醇抽提和丙酮沉淀。得到Nisin干粉活性为3.0×107IU/g。对于富含丙酮层的处理步骤则是很复杂的，包括在丁醇乙酸系统的分离和大量丙酮沉淀步骤，这样得到的Nisin活性是 2.8×107 IU/g次方法的缺点主要是丙酮不能使乳酸链球菌肽完全沉淀,效率较低。
3.2.2 菌体吸附法 细菌素产生菌的细胞都能吸附它所产生细菌素分子。1911年研究发现这种吸附是具有依赖性的，利用这个特性建立了菌体吸附法提取Nisin的方法。经研究发现，Nisin发酵液在pH6.5时对产生菌细胞吸附能力最强，完全吸附出现于发酵液pH<3.0时。国内有研究对乳酸乳球菌随pH的改变吸附Nisin的规律进行研究，通过调整pH使乳酸乳球菌进行选择性的吸附、释放Nisin并达到较好的分离效果。此法为分离Nisin提供了理论依据，但是存在着损失率偏高的问题。
3.2.3膜分离法 利用分子量为1000道尔顿的中空纤维膜对经过离心处理菌体的发酵液进行超滤，最终浓缩率达到5，收率达到74.2%，纯化程度为1.3。利用膜分离方法对Nisin进行浓缩具有非常广阔的应用前景。
3.2.4盐析法 4℃～6℃子将经过超滤浓缩的菌体发酵液中加入60%饱和度的硫酸铵，搅拌后在10000×g离心力离心，收集沉淀得到Nisin粗制品。盐析法收率可以达到62%，纯化程度20，安全可靠，所得蛋白质不丧失活性，是一种比较理想的分离纯化方法。但使用该方法的过程时，发酵液中的杂蛋白质液随之沉淀，所得产品质量受影响。
3.2.5泡沫分离法 Nisin是一种由34种氨基酸组成的多肽，其结构由亲水端和疏水端组成，是名副其实的表面活性剂，因此，理论上可以采用泡沫分离技术将其提取出来。将5%CO2的氮气鼓入培养基，所形成的泡沫微微移动到30℃角置于培养基表面直径1英寸的玻璃管中，最终收集到这个容器中的泡沫含有90%乳链菌肽。
3.2.4其他方法 除了上述几种方法以外，还有采用免疫亲和层析法分离纯化法以及免疫磁珠分离法来进一步纯化乳链菌肽。
4.Nisin的应用
4.1 在食品工业中的应用
4.1.1 在牛乳及乳制品中的应用 Nisin添加在乳制品中解决了由于耐热性芽孢繁殖而变质的问题，并且较低浓度的Nisin便可以大大延长商品的货架期，而且Nisin可以改善牛乳由于高温加热而出现的不良风味。有研究表明在牛乳中添加400IU/g Nisin可使牛乳中的含菌数比未添加的低4个对数周期，贮存期达11天。研究表明在经巴氏处理的干酪中加入500～1000 IU/mLNisin能阻止梭菌的生长和毒素的形成，同时还能降低食盐和磷酸盐的用量，最大程度的保护了产品中的营养成分。
4.1.2 在肉制品中的应用 有研究指出肉制品中葡萄糖食盐溶液对保持肉样感官品质方面效果较好，配合使用Nisin和溶菌酶处理后理化指标、微生物指标都很理想，可以用于小包装分割冷却肉的保鲜剂为18% NaCl、4.5% 葡萄糖、0.5‰ Nisin和0.5‰ 的溶菌酶。利用Nisin结合真空包装可以有效降低鲜肉初菌数，明显延长货架期，经过正交实验，筛选确定保鲜剂配方中加入0.3% Nisin。此配方可以使鲜肉经真空包装后延长货架期至21天。
4.1.3 在果蔬制品中的应用 Nisin对苹果汁、橘子汁和葡萄汁中的泛酸芽孢杆菌有抑制作用，3种果汁中Nisin的添加量仅为5 IU/mL。且Nisin与EDTA联合使用，对梨子汁中芽孢杆菌有明显的抑制作用。将Nisin溶解后按照200ppm的比例添加到蔬菜淹制品中装瓶，115℃15分钟灭菌，37℃和55℃保温22天，样品败坏率为0。
4.2 在医药工业中的应用
Nisin在微生物之间不存在交叉抗性，因此有抗生素的治疗作用。它不同于其他抗生素，细菌不会对其产生抗性，比抗生素对细菌更有效果，且用量也小得多。现已经知道利用乳酸菌杀死肠道内有害微生物，改变肠道微环境，并推出治疗便秘、痢疾和伤寒的菌株Mutaflor。研究发现，Nisin可用于治疗胃和十二指肠溃疡、口腔溃疡、皮肤病、结核病及由链球菌、葡萄球菌引起的牛乳腺炎。
5. Nisin的发展前景
Nisin在实际中的应用效率依赖于应用对象的类型、微生物类型和数量，一般认为，Nisin在pH<6的酸性环境中最为有效。随着人们生活水平的提高，健康食品、绿色食品的概念越加受人关注，对高效、无毒的天然食品添加剂的研究和应用也越来越受到重视。现阶段对Nisin的研究还处于初级阶段，这也给予我们科学工作者的机遇与挑战，即从自然环境中筛选出安全稳定、生态效益强、更利于生产的优良高产Nisin菌株，实现商业化生产，与当今先进的生物技术（如蛋白质工程、基因工程、细胞工程等）相结合，更好的服务于人类生活。
