乳链菌肽的发酵及分离纯化工艺研究进展

2乳链菌肽的分离纯化

2.1盐析法

    由于Nisin是一种小分子肤，故可采用盐析法进行分离纯化。Daoudi等，ion在4℃将通过超滤浓缩的发酵液中加人60%饱和度的硫酸钱，恒速搅拌，然后在10 OOOxg下离心，收集沉淀得到Nisin的粗制品，此法收率达到60%，纯度由原来的0.8%提高到20%。但是硫酸钱的后处理难度较大，废水中的硫酸钱会对环境造成严重污染，且残留在食品中的少量硫酸钱可被人的味觉感知，影响食品风味。而利用氯化钠沉淀则可避免上述缺点，且它本身就是商品化Nisin中的一种赋形物，不用进行脱盐处理。赵艳丽等，川利用正交试验，对此工艺进行优化，得出在pH 3.5、温度40 0C ,发酵液中加盐量为60%的饱和度，盐析1.5 h时，Nisin的收率可达到94.75% o

2.2菌体吸附法

    一般来说，细菌素产生菌细胞都能吸附其产生的细菌素分子。Yang等，12研究了Nisin等四种细菌素的吸附性质，发现这些细菌素的最适吸附pH值大约在6.0左右，解吸附的pH值大约在2.0左右。以此设计了Nisin的提取方法:将L. lozctas ATCC11454稳定期早期细胞调至pH 6.5吸附Nisin , 70 0C加热25 min杀死细胞并使蛋自水解酶失活，离心回收细胞，洗涤，并将菌体重新悬浮于pH 2.5的NaCI溶液中，4℃条件下搅拌1h以释放Nisin，离心除去细胞碎片，将含有Nisin的上清液放人截流相对分子质量为1 000的透析袋透析，然后冻干，最终收率可达93.3% o

2.3层析法

    Coventry等，13利用一种食品级的硅藻土硅酸钙抗凝结剂Micro-Cel E，直接吸附发酵液中的细菌素，然后再将其洗脱下来，每克该物质可吸附25 600 IU的Nisin。该方法得到的Nisin为复合体，在pH1.0}12的范围内都不能使吸附的Nisin解析下来。最后利用1/10体积的1%SDS洗涤吸附后的树脂30 min，洗脱液中的Nisin活性可达80%以上，纯化128倍。将洗脱液在2℃条件下放置16h可沉淀除去68%的SDS，由于SDS是一种去垢剂，故不宜在食品中使用。

    Suarez等”a服道了利用免疫亲和层析一步纯化Nisin的方法。先将AD10杂交瘤细胞产生的抗NisinA单克隆抗体结合到N-轻基丁二酞亚胺活化的HiTrap柱上，然后将过滤除菌的发酵上清液过柱，使Nisin与抗体结合，并用2.5倍体积的磷酸缓冲盐溶液洗柱，最后用2倍体积的甘氨酸一盐酸盐缓冲液将Nisin洗脱下来。在此过程中，发酵液流经柱子后有25%的Nisin未能与抗体结合，洗涤时会流失约3%的Nisin，最终仍可回收72%的活性产物。利用免疫亲和层析虽然快速、简便、纯度高，也不需要复杂设备，但是载体价格昂贵，机械强度低;抗体制备既费时成本又高，且在洗脱过程中容易失活，故而也很难应用到大规模工业生产中。

2.4泡沫分离法

    泡沫分离技术于1977年被引人生物分离领域，应用于多种具有表面活性的蛋自质及酶的分离纯化中，在实验室阶段取得了良好的分离效果。Nisin是一种由34个氨基酸组成的多肤，它的结构由亲水端和疏水端组成，是一个名副其实的表面活性剂，因此理论上能够采用泡沫分离技术将Nisin由发酵液中提取出来。Hirsch }}s’提出利用泡沫技术回收Nisin，其将含5% COZ的氮气鼓人培养液中，所形成的泡沫被移动到30。角置于培养基表面直径1英寸的玻璃管中，收集到这个容器中的泡沫含有90%的Nisin，而这些泡沫只占生长培养基体积的1/10。此法效率高，能耗少，操作简便，无污染，并且易于推广到大规模的工业生产中，是一种很有前景的提取工艺技术。天津康益生物工程有限公司申请的专利“Nisin的分离制备方法”中就采用泡沫分离和盐析分离法提取Nisin,说明该分离纯化法已应用于实际工业生产中。

2.5双水相胶束系统分离法

    1996年，美国麻省理工学院的Liu}}bl等人提出了双水相胶束系统的概念。双水相胶束系统作为一种新型分配系统，具有含水量高，不会引起生物活性物质失活或变性，可直接从含菌体的发酵液和培养液中提取所需的物质等特性，因此，在对天然产物和抗生素等的提取纯化中具有很大的优势和潜力。Jozala等，of以2%非离子表面活性剂TritonX-114为成相剂对Nisin进行分离纯化，结果显示，Nisin优先聚集到胶束富集区。虽然Nisin在富集区和另一区的分配系数只有2左右，远没有达到分离纯化的标准，但该技术开辟了Nisin分离纯化的新途径。