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内外兼修,途径内限速酶改造结合途径间协调表达构建产异戊二烯大肠杆菌

   日期:2016-07-05     来源:上海工业生物技术研发中心    作者:王心    浏览:1654    评论:0    
核心提示:以大肠杆菌为宿主合成异戊二烯,利用蛋白质工程(易错PCR技术)对MEP途径限速酶DXS、DXR和IDI改造,结合启动子工程对MEP途径和下游途径协调表达,最终产量达到17.5 mg/L。
  
 摘要:以大肠杆菌为宿主合成异戊二烯,利用蛋白质工程(易错PCR技术)对MEP途径限速酶DXS、DXR和IDI改造,结合启动子工程对MEP途径和下游途径协调表达,最终产量达到17.5 mg/L。

代谢工程经常用于微生物异源合成相关产物,然而产量的高低或者说整个代谢途径是否足够通畅经常受限于代谢途径酶活的不足以及途径之间的协调平衡。异戊二烯作为一种广泛应用的萜类物质,在大肠杆菌合成已有大量研究。类异戊二烯化合物生物合成的前体物质是异戊烯基焦磷酸(IPP)和其异构体3,3二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。自然界中合成这两种前体物质的代谢途径有两种:一种是甲羟戊酸(MVA)代谢途径,主要存在于原核细胞、藻类及高等植物的叶绿体中;另一种是4-磷酸甲基赤藻糖醇(MEP)代谢途径,主要存在于真核细胞、古细菌和高等植物的胞液中。

以在大肠杆菌利用MEP途径合成萜类物质为例,途径中1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)以及IPP-DMAPP异构酶(IDI)被认为是该途经的限速酶,对以上酶类的改造是萜类合成研究的一个方向。此外,MEP途径和下游异源异戊二烯合成途径之间的配合协调,即途径间的平衡问题,也是研究的另一个方向。

 

浙江大学的研究人员针对以上两个方向,对大肠杆菌MEP途径产异戊二烯进行了概念论证性研究。首先针对MEP途径内部的限速酶DXS、DXR以及IDI,利用易错PCR技术进行随机突变,对获得的突变体库进行筛选,以颜色代谢产物番茄红素作为表征,选取深色大肠杆菌菌落作为目标突变体。新的突变体相比于出发菌株异戊二烯合成有60 %提高。针对途径间平衡即第二个方向,研究人员采用启动子工程技术,以期对完整的合成途径协调表达,叠加第二步工作后异戊二烯产量相比于单纯的限速酶改造提高2.9倍,是出发菌株的4.7倍。

内外兼修,途径内限速酶改造结合途径间协调表达构建产异戊二烯大肠杆菌

 

该工作结合蛋白质工程(易错PCR突变体库筛选)和启动子工程构建大肠杆菌异戊二烯菌株,最终产量达到17.5 mg/L。

 
 
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