丹麦理工大学（DTU）的Alex T.Nielsen课题组通过实验室适应性驯化大肠杆菌，提高了L-丝氨酸的生产。以葡萄糖为碳源，经过50 h的发酵，L-丝氨酸的最终产量为37 g/L，转化率为24%。同时，该研究暗示了thrA，rho，lrp，pykF，eno，rpoB等基因在提高菌株丝氨酸耐受性方面的作用。该研究成果已于2016年11月28日被metabolicEngineering杂志接收。
1背景介绍
L-丝氨酸是一种生物基础原料，主要应用于化妆品和医药行业，年产量大概在400吨。在以葡萄糖为底物生产的所有氨基酸中，L-丝氨酸的理论得率是最高的，但在实际生产过程中，其得率很低。
在大肠杆菌中，有两条L-丝氨酸分解途径，分别是：（1）L-丝氨酸脱氨生产丙酮酸，这步反应由基因sdaA，sdaB，tdcG编码的酶催化；（2）L-丝氨酸生成甘氨酸，这步反应由基因glyA编码的酶催化。最近，作者证明了通过敲除大肠杆菌的L-丝氨酸分解途径可以获得高转化率的L-丝氨酸。然而，丝氨酸的毒性在很大程度上限制了丝氨酸的生产。L-丝氨酸会抑制细胞分化、肽聚糖合成、细胞活性。在这之前，作者通过紫外诱变提高了菌株的丝氨酸耐受性，同时L-丝氨酸产量也提高了，证明了提高丝氨酸耐受性就能提高L-丝氨酸产量。
适应性驯化是提高菌株耐受性的常用方法。为了提高菌株的丝氨酸耐受性及L-丝氨酸的产量，本文采用适应性驯化的方法。
Figure 1. Schematicrepresentation of the study performed to increase serine tolerance andproduction
1文章脉络
首先，作者敲除了L-丝氨酸分解的两条途径（敲除基因sdaA，sdaB，tdcG和glyA），构建了菌株Q1。菌株Q1的生长由于丝氨酸毒性受到抑制，产量也无法提高。作者采用适应性驯化的方法，选取5株Q1，每个菌株两个平行，往培养基中逐渐提高添加的L-丝氨酸的浓度（3,12,24,50,75,100 g/L），总共驯化45天。驯化结束，取终点的细胞测量在L-丝氨酸浓度分别为0，12.5，24，50 g/L时，细胞的比生长速率。驯化菌株的L-丝氨酸耐受性明显得到提高。
对驯化菌株进行全基因组测序，从而找到驯化菌株发生的突变。在驯化菌株中，高丝氨酸脱氢酶基因（thrA）以及thrA，rho，lrp，pykF，eno，rpoB等基因都发生了突变。
为了验证这些基因对提高菌株L-丝氨酸耐受性的作用，分别将这些突变引入菌株Q1中。由于在3株驯化菌株中都发现了thrA突变体（Y356C，S357R，S359R），因此猜测thrA突变对提高菌株L-丝氨酸耐受性非常重要。通过SacB system将thrA突变引入菌株Q1中，发现确实能显著提高菌株L-丝氨酸耐受性。其他基因通过MAGE系统引入菌株Q1中，发现也能不同程度提高菌株L-丝氨酸耐受性。
除了突变，在驯化菌株中还发现了许多基因簇。作者推测这些基因簇也与菌株L-丝氨酸耐受性提高有关。
高丝氨酸脱氢酶（ThrA）与支链氨基酸合成有关，并且受到L-丝氨酸抑制，但是机理和抑制位点还没确定。为了进一步探究ThrA突变的氨基酸残基是否是L-丝氨酸潜在的结合位点，作者基于产甲烷球菌的ThrA构建了一个同源的ThrA蛋白模型。研究发现，这三个突变氨基酸残基与苏氨酸抑制位点很接近，357位丝氨酸的羟基与L-丝氨酸的氨基形成氢键。当357位丝氨酸突变成精氨酸时，会形成位阻阻止L-丝氨酸的结合。
在之前的研究中，大肠杆菌生产L-赖氨酸，培养基中需要添加苏氨酸。作者发现，这驯化菌株中，培养基中不需要添加苏氨酸。
为了评估驯化菌的L-赖氨酸生产能力，在驯化菌株中过表达L-赖氨酸合成途径（抗反馈抑制的serAmut，serC and serB）和thrA突变体。其中，ALE-5菌株性能最好。因此，ALE-5被用来做补料分批发酵生产L-丝氨酸。经过50 h发酵，L-丝氨酸产量达到37.3 g/L，转化率为0.24 g/g。
