芽胞杆菌是一种重要的工业微生物生产菌株，目前广泛用于多种生物化学品的工业生产。然而，高效遗传操作工具的缺乏阻碍了芽胞杆菌的开发和应用推广。近日，来自华中农业大学/湖北大学的陈守文教授实验室研究人员在地衣芽胞杆菌中建立了基于CRISPR-Cas9 nikcase的高效基因组编辑工具，相关文章“Developmentof an Efficient Genome Editing Tool in Bacilluslicheniformis Using CRISPR-Cas9 Nickase“于2018年1月12日发表在杂志Applied and Environmental Microbiology上。
目前，基于II-A型CRISPR / Cas9系统的基因组编辑系统主要分为两类：Cas9介导的基因组编辑和Cas9nickase（Cas9n）介导的基因组编辑系统。之前的研究表明，Cas9对部分细菌宿主具有较强的毒性，相比之下，Cas9n的应用可更有效的避免毒性导致的致死效应。本文中，研究人员以地衣芽胞杆菌DW2为出发菌株，将含有D10A突变位点的Cas9n整合至DW2基因组上，然后将gRNA表达框和同源臂放在同一个质粒上。借助 CRISPR/Cas9n系统，使用长1.0kb的同源臂进行敲除时，基因yvmC的编辑效率高达100%。随后，研究人员针对同源臂长度进行了优化，除了1.0kb的同源臂外，还验证了长为 0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.5kb、0.7kb分别对基因编辑效率的影响。结果表明，随着同源臂的截短，编辑效率随之降低，其中0.1kb条件下的编辑效率约为51.4%，1.0kb的编辑效率最高。之后，研究人员又验证了双基因的敲除效率为11.6%；并以79.0%的效率实现了长约42.7 kb的大片段的删除。除了上述的单基因敲除、双基因敲除和大片段敲除，研究人员还验证了外源基因的整合，实现了纳豆芽胞杆菌来源的纳豆激酶基因aprN以76.5%的效率整合至地衣芽胞杆菌DWc9n基因组上。最后，研究人员还将CRISPR/Cas9n系统应用于异源蛋白表达宿主菌的改造中，他们使用该系统成功敲除了地衣芽胞杆菌DWc9n中的六个胞外蛋白酶基因和杆菌肽合成基因簇，获得了宿主菌DWc9nD7，并将纳豆激酶的表达质粒pP43SNT-SsacC分别导入DWc9nD7和DWc9n中。 发酵结果表明，菌株DWc9nD7/pP43SNT-SsacC的纳豆激酶活力可达59.7 FU/mL，相比对照菌株DWc9n/pP43SNT-SsacC提高25.7%。
本文中借助CRISPR/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌中成功实现了单基因敲除、多基因敲除、大片段敲除和单基因整合，在芽胞杆菌中建立了快速高效的基因组编辑工具。本文的研究成果将有助于芽胞杆菌工程菌株的构建及其产业开发推广，并推动芽胞杆菌合成生物学发展。
