恶臭假单胞菌是一种非致病革兰氏阴性菌，由于具备丰富的代谢多样性和对多种恶劣条件的耐受性，近年来越来越受到人们的关注，被作为一种理想的底盘细胞用于生物降解、生物催化以及化学品的合成。近日，浙江大学吴坚平实验室在恶臭假单胞菌KT2440中建立了基于CRISPR-Cas系统的基因编辑工具，可快速实现KT2440中的基因编辑和转录抑制。 该文章《Genome editing andtranscriptional repression in Pseudomonas putida KT2440 via the type IICRISPR system》近日发表于Microbial Cell Factories杂志上。本研究质粒获取方式请见文末。
本文中，研究者分别利用Cas9和Cpf1两种热门CRISPR–Cas系统，在恶臭假单胞菌模式菌KT2440中成功建立了快速基因编辑方法。结果显示，利用本文开发的CRISPR–Cas9方法可5天内实现KT2440中的基因敲除、插入或替换，编辑效率超过70%。基于该CRISPR–Cas9系统，研究人员进一步开发了无痕的两步法单碱基突变方法，可克服对PAM序列的依赖，实现KT2440中的单碱基突变，效率高达100%。此外，研究人员利用核酸酶活力缺陷的Cas9突变体（dCas9）实现了KT2440中基因的转录抑制，可对KT2440中表达的egfp基因表达水平降低至28.5%，29.4%和 72.1%。
在2017年10月，西班牙研究人员率先在Biotechnology Journal杂志上发表了在恶臭假单胞菌KT2440中建立CRISPR-Cas9基因组编辑方法的文章（下称“BTJ文章”），与BTJ文章的三质粒系统相比，本研究应用了可快速进行质粒消除的双质粒系统，使得对KT2440的快速（5天）、连续编辑成为现实。虽然与BTJ文章在单基因敲除、单碱基突变效率基本一致，本研究在建立单碱基编辑方法时克服了对PAM序列的依赖；此外，本研究进一步完善了CRISPR-Cas系统在KT2440中的应用，实现了基因插入、替换以及转录抑制；同时CRISPR-Cpf1系统的成功建立也更加拓宽了CRISPR-Cas工具箱在KT2440的应用。
本文所构建适用于恶臭假单胞菌KT2440的CRISPR-Cas双质粒系统已在Addgene（http://www.addgene.org/）和金斯瑞（Genscript，https://www.genscript.com/）公布。Addgene编号：pCAS-RK2T(106400)，pSEVA-gRic6T(106401)和pCAS-ZE3(106402)。金斯瑞编号：pCAS-RK2T(MC_0000261)，pSEVA-gRic6T(MC_0000262)，pCAS-ZE3(MC_0000263)。
