通讯作者：陈涛，天津大学化工学院教授、博导
研究方向：基因组尺度代谢网络模型的重构，代谢途径的模拟设计。重要生物基化学品的代谢工程研究和微生物细胞工厂开发。基因简化，底盘细菌。
文章摘要：
利用枯草芽孢杆菌生产核黄素已有20年的历史，但如何理性地构建核黄素高产菌株，路线依然不完全清晰。本研究通过结合基因组测序和转录组分析，揭示了枯草芽孢杆菌高产核黄素的基因机理。
通过该方法成功识别出B. subtilis 24/pMX45突变菌株中的有利突变，这些突变涉及ribC(G199D)、ribD+(G+39A)、PurA(P242L)、CcpN(A44S)、YvrH(R222Q)，和两个无义突变YhcF(R90*)、YwaA(Q68*)。将这些突变引入野生株中，野生株可以获得高产核黄素的表型。随后的基因工程改造进一步提高了核黄素的生产效率，产量提高到B. subtilis24/pMX45的3.4倍。
此外，还发现一个新的基因突变YvrH（R222Q），与嘌呤代谢双组分调控系统相关，可实现对嘌呤从头合成解除调控，从而提高胞内嘌呤代谢中间物，进而提高核黄素的产量。
概括来说，我们展示了如何通过整合基因组及转录组分析，从基因层面来阐明复杂的细胞特性。这有利于我们将有利突变引入标准株，并将其改造成为高产菌株。
研究路线：
1 全基因组测序识别基因组的改变
B. subtilis24/pMX45突变菌株中总共发现513处改变，其中有29处插入，20个删除，464个替换。其中，459个在ORF区，54个在非ORF区。基因间序可通过DBTBS网站来对其功能进行分析。在这些突变中只有很少的一部分与核黄素代谢相关。它们包括中心C代谢的CcpN(A44S)、ywdH (deletion)、citZ+(T148+A)，嘌呤从头合成的PurA (P242L)、PurC (K5N)，嘧啶代谢的PyrC (N136S)，以及核黄素合成的RibC (G199D) 和ribD+ (G+39A)。
2 RNA-seq分析突变在核黄素高产中的作用
共有945个基因表现出明显的变化，我们分析了与核黄素代谢相关的通路基因，其水平如下图。其中，核黄素生成的末端途径的基因表达水平都升高，而前体供应的基因表达水平并没有相应的提高，这可能对进一步提高核黄素产量提供了改造依据。中心C代谢的水平都降低，C流入PPP途径增多，有利于核黄素的生产。
3 有利突变的识别及其与核黄素高产的联系
构建了一系列菌株，通过不同菌株间的比较，发现了7种有利突变，包括RibC(G199D)，ribD+(G+39A)，PurA(P242L)，CcpN(A44S)，YhcF(R90*)，YwaA (Q68*)和YvrH(R222Q)。其中，RibC(G199D)，ribD+(G+39A)，PurA(P242L) 和 YvrH (R222Q)有非常突出的作用。
4 通过基因工程对核黄素生产菌株进行重构
通过引入有利突变及基因工程改造，得到一系列菌株，其中BSW125是突变菌株的产量的3.4倍。
5 突变导致核黄素高产的原因
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RibC (G199D)，ribD+(G+39A)
RibC (G199D)突变可降低该酶95%的活性，可减少核黄素的消耗及FMN的积累。ribD+(G+39A)突变，改变了前导调控区，可解除FMN绑定抑制。
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CcpN(A44S)
CcpN(A44S)可解除对gapB和pckA的调控抑制，加强糖异生及PPP途径，使C流入PPP途径增强，有利于核黄素的生产。
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PurA (P242L)
PurA (P242L)可造成腺嘌呤缺陷，竞争途径的减弱，prs、purF和guaC表达都上调，有利于核黄素的生产。
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YvrH(R222Q)
YvrH是双组分调控因子，它对lytABC有抑制作用。YvrH(R222Q)突变解除了该抑制作用，LytC的高表达影响了细胞壁的透性。一些基因的表达上调，如purF，purS，purL，purQ，purM，purN，purH和purD。胞内IMP，GMP，GDP，GTP，AMP，ADP和ATP的浓度也有提高。所以核黄素的产量才有所提升。
