丙酮酸是一种重要的有机酸，在食品、医药、化工和化妆品等行业都有广泛应用。目前，工业上生产丙酮酸主要采用化学法，由于化学法合成丙酮酸的过程中存在严重的安全问题，在食品和化妆品的应用中受到限制。因此，采用代谢工程改造微生物，利用可再生资源生产丙酮酸，对降低生产成本、拓展应用领域均具有重要意义。针对光滑球拟酵母生产丙酮酸过程中存在的产物胞内亚细胞分布积累对菌株生长和产物合成效率存在较大影响的问题，本研究利用丙酮酸特异性载体来操作丙酮酸在不同亚细胞的分布趋势来探索和解析其对菌株生长和丙酮酸积累的影响，有效的强化了胞内丙酮酸的高效积累。
研究成果
在本研究中分别通过在光滑球拟酵母的线粒体膜和细胞膜上表达来自于Saccharomyces cerevisiae S288c的线粒体丙酮酸载体（MPC），用于调控丙酮酸在不同亚细胞中水平，达到促进中心碳代谢流和丙酮酸胞外积累。通过强化丙酮酸进入线粒体的速率来增加线粒体丙酮酸分布，获得了较高的中心碳代谢速率、比生长速率和比丙酮酸生产速率。通过比较工程菌和对照菌的胞内丙酮酸含量及其积累趋势，发现较高的胞内丙酮酸水平不利于改善丙酮酸产率和中心碳代谢效率。此外，通过质膜表达MPCs加速丙酮酸分泌进入细胞外环境，使得胞内丙酮酸的积累趋势由不断上升转变为缓慢下降。同时调控了糖酵解相关限速酶的表达水平。最终丙酮酸的产量提高了134.4%。此外，本研究还建立了一种结合分选酶介导的体外连接和流式细胞仪快速检测的新型质膜定位验证方法，对于研究类似过程具有一定的普适性意义。
成果信息
本文以“Enhanced pyruvate production in Candida glabrata by carrier engineering”为题发表于“Biotechnology and Bioengineering”期刊，国工罗正山为第一作者，陈坚教授和周景文教授为共同通讯作者。这一研究受到了中国国家高技术研究发展计划（863计划，2015AA021003）、国家自然科学基金（31670095）和江苏省特聘教授项目支持。
图1 设计MPC载体的不同亚细胞定位对菌株生长和丙酮酸胞外积累的影响
图2 基于分选酶介导的体外连接反应的膜定位验证方法的流程图
构建含有LPXTG基序的线粒体丙酮酸载体的表达框。表达，纯化和收集含有特定N-末端Gly重复序列（α-Glyn）的EGFP。接着，培养和收集含有线粒体丙酮酸载体表达框的细胞，使得其在分选酶A的介导下与EGFP（gly4）体外反应15-20分钟（37 ℃）。最后，通过流式细胞术和荧光显微镜检测这些细胞的荧光特性。
