Δ9-四氢大麻酚酸（THCA）是来自植物大麻的植物来源的二级天然产物，其具有治疗适应症，例如用于癌症疼痛的镇痛药，降低青光眼中的眼内压或减少与多发性硬化相关的痉挛。在这里，科学家们通过将细菌异戊二烯基转移酶NphB与THCA形成酶组合，重建了酵母中来自C. sativa的THCA生产的晚期生物合成途径。 这些工程酵母标志着微生物宿主中有价值的大麻素的总生物合成的重要一步。
介绍
大麻已在民族医学中使用了3500多年，并在上个世纪初被禁止作为非法药物之前被用作合法的草药。THCA是药理活性成分，其结构于1964年首次阐明，并在各种药理学试验中作为治疗症状的潜在药物靶点进行测试。THCA是药理学活性成分，其结构在1964年首次阐明，并在各种药理学试验中作为治疗不同疾病症状的潜在药物靶点进行测试，如多发性硬化症中的震颤，抗肿瘤化疗期间的呕吐，创伤后应激等。除了THCA之外，到目前为止还描述了100多种其他大麻素，它们主要在位于叶子上的毛状体中生物合成，并且在C. sativa的花芽上具有高密度分布。大麻素是衍生自聚酮化合物和MEP途径的异戊烯化聚酮化合物，其分别递送烷基间苯二酚酸（主要是橄榄酸; OA）和单萜部分（主要是香叶基二磷酸; GPP）（图1）。OA由两种称为橄榄酚合成酶和橄榄油酸环化酶的III型聚酮合成酶生物合成。 第一种致死代谢物向大麻素的高度多样性的生物合成前体是通过C3位的OA的C-C Friedel-Craft烷基化形成的大麻二酚酸（CBGA）。在植物中，该反应通过整合膜蛋白大麻二糖合酶（CBGAS）进行，其可能位于质体的膜中。最后，THCA和大麻二酚酸（CBDA）分别通过四氢大麻酚酸合成酶（THCAS）或大麻二酚酸合成酶（CBDAS）催化的氧化环化从CBGA产生（图1）。
前体香叶基二磷酸（GPP）和橄榄醛酸（OA）被转化为大麻素途径大麻二酚（CBGA）的中间中间体。随后CBGA通过两种不同的氧化还原酶四氢大麻酚酸合成酶（THCAS）和大麻二酚酸合成酶（CBDAS）进一步转化为THC的酸性形式和在腺毛状体中积累的CBD。本研究的异源表达酶以绿色突出显示。 初级代谢的中间体以灰色显示。 MEP，2C甲基-D-赤藓糖醇-4磷酸酯; DOXP，1个脱氧-D-木酮糖-5磷酸酯; MVA，甲羟戊酸; IPP，顺异戊烯二磷酸酯; DMAPP，二甲基烯丙基二磷酸酯; AAE1，己酰-CoA合成酶; OLS，橄榄醇合成酶; OAC，橄榄酸环化酶; CBGAS，大麻酚酸合成酶; NphB，来自链霉菌属的芳香族异戊烯基转移酶。 菌株CL190; D9-THCA，D9-四氢大麻酚酸; D9-四氢大麻酚; CBDA，大麻二酚酸; CBD，大麻二酚; 由Degenhardt等人修改。
用于生产二级天然产物的工程微生物菌株为化学合成或基于植物的生产提供了有趣的替代方案。在微生物系统中重建大麻素途径提供了通过掺入不同的起始单元，通过调整所涉及的酶或通过延长生物合成途径来调节成形产物的可能性，从而导致具有改变的药理学性质的非天然大麻素。然而，生物合成途径的遗传重建在遗传途径组装或调节网络的水平上引起许多工程挑战。酵母，尤其是酿酒酵母，是主要的平台生物之一，遗传学家和生物技术专家以令人印象深刻的方式证明了如何成功地重建导致双氢青蒿素，蒂巴因或白藜芦醇的各种植物途径。然而，Komagataella phaffii通常表现出更好的蛋白质生产率，因此可以为植物衍生的药理活性代谢物提供有趣的替代生产宿主。特别是植物的次级天然产物途径由于复杂和分支途径，所涉及的酶的不适当的催化性质，区室化和不同器官中的特异性调节机制而对微生物提出了许多挑战。例如，THCAS被导入分泌途径并且是C. sativa中的可溶性酶。相比之下，CBGAS是一种完整的膜蛋白，很可能位于植物的质体中。 由于THCAS在原核宿主中作为胞质蛋白的功能性表达失败，大麻素途径的重建还包括不同生物合成酶的区室化。 用CBGA表达酵母菌的喂养实验表明形成了THCA。 因此，中间产物CBGA通过膜的运输不是限制性的。
除了表达足够量的催化缓慢的次级代谢酶外，由于正确的蛋白质折叠和不正确的细胞器定位以及伴随的其他分区问题的问题，整合膜蛋白（如CBGAS）在异源生物合成途径中的应用是具有挑战性的。为了避免这些不可预测的障碍，科学家们选择了来自菌株CL190的可溶性芳香族异戊烯基转移酶NphB来代替CBGAS。 NphB催化香叶基部分转移到各种芳香受体分子。在先前的研究中，显示NphB能够在C2和C4位置预先二羟基萘，几种类黄酮和聚酮化合物，特别是橄榄酚（OA的脱羧形式）。除了C-香叶基化的形成之外，NphB催化形成与芳族底物的O-异戊烯基键。与对芳香族底物的混杂特异性相反，NphB仅接受GPP作为异戊烯基供体。 但无论其松弛的底物特异性如何，NphB通常表现出对异戊二烯基团转移的高区域选择性。总之，这使得NphB成为替代植物来源的膜结合的异戊烯转移酶的有希望的候选者。
科学家们之前使用来自液泡蛋白酶A的蛋白酶A的信号肽描述了THCAS在酿酒酵母和K.phaffii中的功能性细胞内表达。科学家们研究开发酵母作为大麻素生物合成的平台生物，他们建立了NphB作为生产CBGA的替代生物催化剂。随后，科学家们将异戊烯转移酶的表达与K.phaffii中的THCAS偶联，导致从OA和GPP成功产生THCA。由此，产生82±4.6pmol L -1 OD -1 h -1 THCA。
NphB能够生产CBGA
为了避免表达完整膜蛋白CBGAS的问题，科学家们尝试使用来自菌株CL190菌株的可溶性芳香族异戊烯基转移酶NphB。 以前的研究表明NphB能够预先表达OA。因此，在GAL1启动子（SC_N）控制下携带NphB编码序列的酿酒酵母CEN.PK细胞用于表达可溶性异戊二烯基转移酶。用GPP和OA进行活性测定的HPLC分析显示形成两种产物，m / z为361.23。保留时间为1.6分钟的峰与CBGA的标准化合物（图2）相同，表明NphB确实能够将OA预表示为CBGA。在1.7分钟时的第二个峰显示相同的m / z为361.23但是具有不同的MS 2谱（支持图S1），表明NphB在不同位置预先分析OA。根据Kuzuyama等和Kumano等的说法NphB催化许多含羟基芳族受体的碳 - 碳和碳 - 氧基香叶化。NphB可能的OA异戊烯化位点如图3所示。为了进一步阐明未知化合物，通过制备型RP-HPLC分离相应的峰，然后进行NMR分析（补充信息）。 这表明NphB能够优先在2-O位置对OA进行环烷基化，从而产生2-O-香叶基橄榄油酸（2-O-GOA）。 通过HPLC-MS无法检测到m / z为361.23的其他异戊烯化产物。
NphB和THCAS的融合
科学家们发现表达nphB的酵母提取物通过GPP催化OA的异戊二烯化形成CBGA，CBGA是THCAS形成THCA的底物。基于这些结果，科学家们试图在酿酒酵母中同时表达两种酶。 在第一种方法中，通过病毒T2A序列实现THCAS和NphB的两个编码序列的分离，所述病毒T2A序列能够实现由单个启动子驱动的两种酶的真核表达。该构建体设计有上游thcas和下游nphB，因为不知道THAAS的N-末端前导肽的功能是否会在T2A肽序列的共翻译切割时受到额外的脯氨酸的负面影响。
用pDionysos_TT2AN转化酵母菌株SC并培养168小时。每24小时采集用于OD 600测量和活性测定的样品。在将OA和GPP补充到细胞裂解物后分析产物形成。 结果如图4所示显示了CBGA和2- O-GOA的产生，但没有形成THCA。2.5pmol L -1 OD -1 h -1的低CBGA生产率表明CBGA浓度可能不足以进行随后的THCAS氧化环化。 补充有OA和GPP的SC_N裂解物的酶活性表明分别表达的nphB的表达率高于与thcas共表达的表达率（图4）。可检测到诱导后144小时SC_N的最高CBGA生产率（12pmol L -1 OD -1 h -1，图4）。在诱导后120小时（126pmol L -1 OD -1 h -1，图4）可检测到补充有CBGA的SC_TT2AN裂解物的最高可能THCA产生率，而SC_T的最高THCA产率已经在诱导后96小时达到。
（A）仅表达thcas（SC_T，（a）），仅nphB（SC_N，（b））或nphB和thcas（（SC_TT2AN，（c）），（SC_NT，（d））的细胞的比较;（B） （c）和（d）中的THCAS活性;表达培养物在OD 600为0.5时接种，并在15℃，200rpm，1L带挡板的摇瓶（10％填充体积）中孵育168小时;将细胞裂解物上清液与1mM OA，1mM GPP，5mM MgCl 2在37℃温育4小时，以确定CBGA，2-O-GOA 22和THCA形成（A）或在37°下用0.3mM CBGA C在4小时内确定在测试条件下可能的最高THCA产量（B）; 通过HPLC-MS分析测定，并在细胞培养物OD 600，细胞培养物体积和测定培养时间上标准化产物形成。 数据点是从生物学一式三份计算出来的，每份都在技术副本中进行分析。
由单个Gal1启动子驱动的nphB和thcas的表达不导致THCA形成。基于此，科学家们测试了酵母的双向Gal10 / Gal1启动子系统，因为在相同系统中重复应用相同的启动子序列可能导致由酵母的高活性同源重组机制引起的构建体的不稳定性。克隆构建体pDio2_THCAS以测试thcas是否在pGal10下功能性表达。 用所需质粒转化酵母菌株SC并培养168小时。 每24小时采集用于OD 600测量和活性测定的样品。补充CBGA的SC_T2裂解物的酶活性显示诱导后72小时获得最高THCA产率（支持图S 4）.SC_T和SC_T2的比较表明thcas 用pGal1表达的pGal1比在pGal10下表达的更有活性。在诱导后72小时，THGAS在pGal1下的表达导致THCA生成率为348pmolL -1 OD -1 h -1。
根据结果，科学家们决定使用pGal1进行nphB表达。 用pDio2_NT转化酵母菌株SC并培养168小时。 每24小时进行OD 600测量和活性测定的样品。在将OA和GPP补充到细胞裂解物后分析产物形成。 图4中显示的结果表明形成了CBGA和2-O-GOA，但没有形成THCA。 诱导后96小时获得最高的CBGA生产率（8pmol L -1 OD -1 h -1，图4）。 诱导后96至168小时，2-O-GOA的形成是恒定的（支持图5）。 在诱导后168小时可检测到补充有CBGA的SC_NT裂解物的最高THCA生产率（233pmol L -1 OD -1 h -1，图4）。
筛选不同的K.phaffii酵母菌株以获得最高的大麻素形成
为了改善nphB表达，科学家们尝试利用K.phaffii在编码序列多拷贝整合到其基因组中时高水平表达蛋白质的能力。因此，科学家们使用先前报道的菌株PP2_HC（Zirpel等，2015），其已经能够在细胞内以高水平功能性表达，并用含有nphB编码序列的大量线性化载体DNA pAX_NphB转化它。 随后，通过菌落PCR检查24个转化体，以成功整合载体DNA，并在向细胞裂解物中补充OA和GPP时，以48孔格式筛选其产物形成能力（CBGA，2-G-GOA，THCA） （图5）。结果表明高表型变种，据推测是由于pAX_NphB的拷贝数不同导致产物形成从20到280pmol L -1 OD -1 h -1。 为了更详细地阐明K.phaffii的THCA生产能力，在摇瓶实验中以更大规模培养克隆C23和克隆C1（低THCA产生）。
K.phaffii中的时间依赖性表达
将表达nphB和thcas的K.phaffii克隆C1和C23以及仅表达一种酶的对照菌株在摇瓶中温育以研究酶活性随时间的变化（图6）。 培养条件适应于之前报道的最佳thcas表达条件。如所预期的，NphB在功能上表达，并且CBGA和2-O-GOA的积累发生在缺乏THCAS的细胞的裂解物中（PP2_N，图7）。 THCA仅在表达nphB和thcas（PP2_NT）的菌株中由GPP和OA产生。 此外，THCAS不接受副产物2-O-GOA作为底物。最后，对具有较高NphB活性的菌株进行的筛选产生了具有5倍增加的生产率的菌株。 PP2_NT C23能够产生615pmol L -1 OD -1 h -1，而克隆C1仅产生125pmol L -1 OD -1 h -1。对于THCA的产生获得了类似的结果，与C1相比，克隆C23增加了6倍。
（A）仅表达thcas（PP2_HC，（a）），仅nphB（PP2_N，（b））或nphB和thcas（PP2_NT克隆C1（c），PP2_NT克隆C23（d））的细胞的比较; （B）PP2_NT克隆C23的培养; 将表达培养物在OD 600为10时接种，并在15℃，160rpm，500mL带挡板的摇瓶（10％填充体积）中孵育96小时; 将细胞裂解物上清液与1mM OA，1mM GPP，5mM MgCl 2在37℃下孵育4小时以测定CBGA，2-O-GOA和THCA形成或用0.3mM CBGA在37℃下测定4小时 在测试条件下确定最高可能的THCA产量; 通过HPLC-MS分析测定，并在细胞培养物OD 600，细胞培养体积和测定培养时间上标准化产物形成。 数据点是从生物学一式三份计算出来的，每份都在技术副本中进行分析。
结论
科学家们的研究表明，使用K.phaffii作为表达宿主，两种酶NphB和THCAS的偶联是成功的。虽然K. phaffii迄今为止主要用于过量的分泌蛋白生产，纯化和表征，但当线性二级生物合成途径应整合到异源宿主中时，它证明了其在代谢工程中的潜力。科学家们在多孔板实验中有效地产生并筛选了基因多拷贝克隆，并且表征了关于其从OA和GPP产生THCA的能力的最佳表达菌株。细胞裂解物能够产生82±4.6pmol L -1 OD -1 h -1 THCA（图6A），但NphB活性在该菌株中是有限的并且产生了相当大量的副产物2-O-GOA。通过定向诱变克服NphB活性和产物特异性问题将是一项重要任务，因为-假设NphB突变体的相同表达和特异活性仅产生CBGA-在该酵母系统中可能产生34倍以上的THCA 赋予THCA生产率100毫克/升和小时规模。虽然产生的异源系统中的产物滴度和速率仍然很低，但是科学家们提出了避免来自苜蓿的整合膜结合CBGAS的麻烦表达的可能性，并证明了开发可持续和安全的大麻素生产酵母平台的潜力。
