—我国可利用生物资源R&D现状与绿色产业发展
杨顺楷 四川 成都
提要 笔者依据近50年的职业道路经历，提出了如标题所述，对我国可利用生物资源R&D现状与绿色产业发展5个论题的看法，应该有益于促进我国产业发展及生态环境建设，即提高资源利用率，降低能源消耗，对环境友好的“金标准”。
1. 甾体激素药业
目前，针对我国传统的薯蓣皂素-双烯v植物甾醇-雄烯二酮（4AD）两条路线转型期的产业发展现状，现在以过去数年我国对全球甾体药业的原料及中间体出口数据为例，2009年国内甾体激素APIs出口总量743.25吨，总金额3.7亿美元；2013,1000吨，8亿美元；2014,1860吨，12.2亿美元；2015,1340吨，9.4亿美元；均价下跌幅度18.0%-24,3%。可见，我国这一行业，在全球2016全球甾体激素药物销售额达1000亿美元，约占全世界医药品总额的>10%的情况下，对我国整体行业而言，并没有产生多少经济-生态环境效益可言。大量的能耗与水资源消耗，发酵废水处理的生态环境保护问题，仍然留在了我国的土地上，这一产业发展趋势值得研究与思考。
薯蓣和大豆对这两种农作物收获量，以及加工所得的半合成甾体中间体数量，数据比较如下：
薯蓣皂素：100平方米种植面积→150kg黄姜→1kg薯蓣皂素；
植物甾醇：80万平方米大豆种植面积→20吨大豆→4吨豆油→10kg精炼馏出物（VOD）→1kg植物甾醇
可见，经由大豆种植加工产出的植物甾醇产率，低于由黄姜种植产出的薯蓣皂素。这从生物资源经济学角度看，显然不难分出优劣高下。伴随着我国野生薯蓣资源枯竭，发展在陕西湖南湖北盾叶薯蓣农业种植2.67-3.33万公顷，薯蓣皂素产量稳定在2000吨/年 的水平，借助我国50余年生产4大基础糖皮质激素（可的松，强的松，氢化可的松，强的松龙）的优势，适度发展黄姜种植，生产薯蓣皂素-双烯物产品，仍然有利于我国贫困农村地区的脱贫，促进我国甾体药业经济稳步发展有好处。关于借助Marker降解薯蓣皂素，制双烯物存在的“铬”污染的环境保护问题，可以通过科技攻关和污染物管控或资源化再利用，能够较好的解决好这一问题。
近年来，甾体类激素产业发展，在以生物发酵转化植物甾醇技术，提供核心中间体AD（D），9a-OH-AD）等，导致改变薯蓣皂素-双烯在甾体类激素传统生产工艺和市场的地位。目前，在新世纪之初，我国靠引进植物甾醇发酵技术，4AD产能已经达到千吨级水平，似乎替代薯蓣皂素延伸产业链已势在必行 。但是，近年的植物甾醇原料，基本上都是依赖进口，例如大豆植物甾醇22-26美元/kg,这要花费数千万美元；反观，我国甾体激素药物工业的半合成原料，已经从薯蓣皂素转变为利用植物甾醇发酵转化，制成雄烯二酮（4-AD）等作为半合成原料，产量已达到千吨级水平，因此每年须得进口数千吨级的植物甾醇；如果能够将目前我国每年进口的8-9千万吨的大豆，经由油脂工业加工的副产物-植物甾醇开发利用起来，按照8000万吨大豆计算，可以开发产出4000吨植物甾醇，那对我国甾体激素药物工业调结构（替代薯蓣-双烯传统路线）将带来重大的贡献。但不知道国内油脂工业部门目前究竟开发利用了多少？这一资源对促进我国油脂工业加工过程资源深度开发，提供生物制造甾体激素药物半合成原料，促进我国甾体药业产业发展，无疑意义重大。
2. 茶叶资源70万吨/年的深度产业开发
茶最早起源于我国，在全球嗜好性饮料中，它是几乎遍及全世界的品种。茶叶作为一种来源于山茶科植物的叶芽，经过各种多样的加工方式，制造成为了多样的茶产品供人们消费。目前全球主要的产茶国家有中国，印度，斯里兰卡，肯尼亚，印度尼西亚，土耳其，以及俄罗斯等，产量均达到十万吨级以上；其中日本的茶叶产量仅有数万吨，但是日本对茶叶及茶饮料研究及开发的水平最高，开发出的多种高档茶叶商品，除了国内消费外，还出口到欧美市场。例如，日本开发的微生物单宁酶，已经被成功用于速溶茶的大规模生产，用以解决茶乳凝，即“冷后浑”问题，并成功投放市场，产生了很好的经济效益。此外，这种单宁酶酶法加工技术，对于茶制品中的生理活性物质—茶多酚（茶单宁）复合物的脱酯，特别是对其中的生理活性物质没食子儿茶素类作用巨大。
目前，我国茶叶产品，除了作为广泛的大众饮茶用途消费外，作为每年产出70万吨茶叶资源产品，已经开始关注并实施茶叶的深加工。目标就是健康保健品的开发。近年来在我国的福建，湖南，四川等地，已经有工业规模的茶叶提取物企业建立起来，即浓缩茶的规模品牌企业出现。这标志着我国开始重视对茶叶资源的深度研究开发。立足其中对茶多酚（茶单宁）类生理活性和药学活性单体或多组分研究开发，经过生物化工或生物制造手段，发展成为可用于食品药品创新型企业的条件已经逐步成熟。特别是聚焦于小分子类的植物化学成分研究，很有可能发现具有生理活性及药物用途的单体先导化合物或多组分天然产物，从而为生物制造走向合成生物学奠定基础。
具体的事例可见笔者的前一篇博文，“FDA为草本植物药制剂开了第一扇窗：药用茶多酚准入”（ 链接地址：http://blog.sciencenet.cn/blog-64804-1153615.html ），该事例说明了开发植源性中药饮片，如何经由其中的活性组分研究，一步步达到与全球主流医药学合流，像屠呦呦发现青蒿素获得诺贝尔生理学医学奖一样的路径。另一个茶叶资源开发，除了茶多酚组分以外，那就是茶叶中非蛋白氨基酸—L-茶氨酸活性物质的开发利用。我国已经于2014年6月正式批准它可用于新食品配料，虽然它比美日批准得晚了一些。这就说明我国已有的若干家生产浓缩茶企业，已经重视茶产品的综合利用及深度开发。除了生产茶多酚外，还可将其废液中的茶氨酸分离回收，制成产品，进入国内外市场；有的企业还将最后的茶渣，并非作为简单的废渣处理，而是通过微生物加工手段，利用安全真菌发酵，生产出可作为饲料配料的产品，以达到茶叶资源原料的全价利用，体现对生物质的绿色加工应用。
3. 300万吨/年谷氨酸发酵产能资源创新之路—生物制造茶氨酸
作为在我国已有50余年生产历史的工业发酵传统产品谷氨酸（钠），特别是过去30年，经由外资外商如日本韩国，以及台商的介入，谷氨酸发酵产能总量已经达到300万吨/年；耗粮500万吨（主要是北方玉米，及部分进口玉米），总体水平尚处于全球2-3流，耗水20亿吨/年，耗能达380万吨/年标煤，年总产值200亿元。国内市场味精（谷氨酸单钠盐）作为调味剂消费已趋饱和，已进入低档商品阶段。过去20年来，生产规模越来越大，能耗水耗增长量相当可观。目前最大发酵罐体积500立米，300立米，120立米较常见；大量的发酵废水的处理技术也尚未取得根本性突破。从国家层面来看，适度限制耗粮（淀粉质）大户发酵生产谷氨酸（钠）低档产品规模是必然趋势；延伸产业链，开辟另一条利用该发酵产业资源的创新之路，就是发展目前国内外风靡全球的药食两用高端产品—生物制造L-茶氨酸（g-谷氨酰乙胺），这是科学合理的创新开发途径。
茶氨酸（g-谷氨酰乙胺）作为一种植源性非蛋白氨基酸（茶叶中存在仅有1-2%含量），绿茶中的鲜香成份。鉴于它在食品，保健品以及医药行业的广泛用途：影响脑内神经递质改变，增强记忆力；镇静/抗焦虑，预防神经功能失调，失眠症，经期综合症，抗抑郁，抗肿瘤，降血压，以及增强人体免疫力的功效，导致引起欧美日和我国科学家，以及企业的研发兴趣。临床医学发现，抑郁症是目前全球各国发病人数过亿的精神疾患（发病率1.5%），美日等国的保健品厂商已经开发上市多种以茶氨酸为主，辅以其他活性植物提取物（缬草根，金丝桃素等）作为天然镇静剂保健品，抗抑郁胶囊上市，疗效显著，长期服用，未见任何副作用。
如今我国发酵产业每年百万吨级谷氨酸产品，不得不作为低值轻化工及食品调味剂（味精）产品进入国内外市场。如何经过工业生物技术的研发，将此大宗低值谷氨酸产品生物转化成为高值国内外市场看好的L-茶氨酸（L-Theanine）产品，就成为生物制造首选项目。国内开发利用g-谷氨酰甲胺合成酶（ g- GMAS）酶法合成L-茶氨酸的研究，可见于李晚军（四川同晟）2015，发明专利，CN105200075 A；以及李元（中科院天津工生所）2016，PPK和GMAS共表达构建重组菌及应用L-茶氨酸的合成研究，已经取得阶段成果。
他们借助生物信息学手段，开展酶基因克隆及遗传工程，选育出合适的重组菌株，成功地将谷氨酸（钠）和乙胺生物转化成为L-茶氨酸。具体的实施内容简述为：参考日本学者的研究工作，即选择来自专性甲基营养菌（Methylovorus mays）菌株 No.9 的g- 谷氨酰甲胺合成酶（GMAS），能在一个含有酵母-糖发酵ATP再生体系偶联反应中，由谷氨酸和乙胺生产茶氨酸；分离的谷氨酸甲胺合成酶（GMAS）基因→pET-21a →表达E.coli AD494（DE3），其酶产能高于母株23倍； GMAS 重组菌具有同母株同样的酶学性质；偶联酵母糖发酵的ATP-再生体系反应，应用膜包封酶制剂体系，由谷氨酸和乙胺产出600mmol茶氨酸，转化率100%（2008-2009）。
四川（德阳）同晟生物科技有限公司研发中心，在产学研合作基础上，同样选择了专性甲基营养菌的γ-谷氨酰甲胺合成酶（GMAS）催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的技术路线，完成了将基因序列优化为大肠杆菌偏好性密码子，并合成基因，构建获得表达γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌工程菌；其中构建了一个ATP再生系统，即采用串联表达多聚磷酸激酶（PPK），腺苷酸激酶和多聚磷酸腺苷酸转移酶，协同联合催化多聚磷酸盐产生ATP，实现ATP再生，为L-茶氨酸生物合成反应提供能量；通过对发酵参数优化，实现了工程菌的高密度高酶活发酵工艺（100L发酵罐）；利用全细胞进行生物转化，在30℃，pH8.0条件下，采取底物流加补料策略，实现茶氨酸生成量44.81g/L，摩尔产率80.16 %。目前工艺稳定，有望实现茶氨酸酶法工业化生（2017.12.30）；2018年该研发团队在乐山中试基地进行了公斤级的放大试验，已经制备获得60多公斤生物制备合格产品。
4. 万吨/年级五倍子和塔拉荚粉碱法水解制没食子酸高耗能旧工艺须得由生物制造绿色工艺取代
没食子酸（GA）是一种重要的有机精细化工产品。它是有机合成、医药、化工、食品、国防、轻工、环保和电子化学品等方面不可缺少的原材料。例如，GA可用于制备3,4,5-三甲氧基苯甲醛（TMB），而它则是合成抗菌磺胺增效剂三甲氧基苄胺嘧啶（TMP）的关键原料。在对没食子酸烷基酯类化合物产品生产，GA的甲氧基化衍生物及众多医药产品的开发利用上，GA都占有十分重要的位置。 GA又是食品、化妆品和饲料的抗氧剂，近年来还用作半导体感光树脂的原料，其脱羧产品—焦性没食子酸也已经广泛用作电影胶片的显影剂、红外照相的热敏剂、苯乙烯和聚苯乙烯的阻聚剂等。
微生物 单宁酶的生物催化应用就是酶法生产没食子酸。因为它在药物工业和化学工业上，在21世纪具有很重要的绿色生物制造价值。此外，没食子酸具有多种潜在的治疗价值，包括抗癌和抗微生物活性，以及其它多种已经广泛使用的没食子酸衍生物，例如焦性没食子酸和有效的食品抗氧剂—没食子酸丙酯。
传统的没食子酸生产工艺使用硫酸（国内用碱法）化学水解天然产物倍单宁，但是它释放出大量的高盐度有机污染物，废水处理十分困难；于是寻求一种生物酶催化工艺，已经成为一种应用单宁酶酶法制造没食子酸产品对环境友好的新工艺需求，用以替代高耗能，且对环境有严重污染的旧工艺。这已经成为必然选择的绿色生物制造途径。
笔者所在实验室过去20年的实验研究成果，可望提供一种具有吸引力的绿色工艺技术途径。安全性好的黑曲霉单宁酶酶法转化五倍子单宁酸，制造没食子酸工艺路线已经建立起来。我们已经在国家自然科学基金实验研究基础上，早在2003-2004与企业合作，取得公斤级酶法制备没食子酸中试放大实验成果，2018年在本所第三方技术主持，在100立升发酵罐上，由企业提供原料，实现了酶法制备没食子酸，重现了酶法工艺制没食子酸（收得率60%<化学法70%）可重现工艺的稳定性。虽然目前GA的收得率，与传统化学法工艺有一定差距，可以相信，通过进一步的产酶菌种的分子育种改造和生物加工过程优化工艺研究，提高GA收得率是大有潜力可挖的。
近年国内精细化学品行业,鉴于传统酸碱法加工五倍子和进口塔拉荚份原料量近万吨，进行化学法生产没食子酸，存在的高耗能及环境污染现实问题，即生产过程产生大量高含盐量的有机废水，治理十分困难，也在国内外寻求解决途径。可以确信，经由所企合作途径， 实现酶法生产GA的生物制造绿色工艺，必将成为现实；加之，已经有德国汉堡大学安博士同样的单宁酶酶法水解生产GA新工艺成果加盟，发展国际合作，难道还有什麽工业生物技术障碍不可克服的吗？
5. 破解千吨/年级规模的我国氯硷化工有毒废料四氯化碳资源—化害为利之道：生物制造苯丙氨酸
根据我国政府已经签约的蒙特利尔条约，消耗臭氧层物质之一的四氯化碳，作为溶剂和终端产品将逐步削减，直至停止使用。四氯化碳主要是生产甲烷氯化物过程中产生的，随着国内甲烷氯化物装置能力的不断扩大，加上四氯化碳目前主要下游产品如氟致冷剂F1 1、F12也面临着淘汰，如不能有效及时地进行四氯化碳转化工作，四氯化碳产品有可能大量过剩。须知我国氯碱化工产业规模大，每年四氯化碳都在数千吨级水平。所以加强四氯化碳转化为肉桂酸，延伸产业链，进入生物制造生产L-苯丙氨酸是一条化解有毒废料的可行之道，而且已经是一条开发成功的成熟工艺路线；2000年前后，浙江巨化公司开发部已经完成这一化工转化，由四氯化碳转化生产的肉桂酸产品（3.1万元/吨）供应给绍兴亚美生化公司酶法生产苯丙氨酸，产品规模达到百吨级，产品质量高，杂酸含量少，非常适合提供作为医药用。“肉桂酸产品链消化四氯化碳的前景展望”一文（杜志明 郑华珍，化工生产与技术，2004,11（5）：27-，浙江巨化股份有限公司发展部，浙江衢州324004)，对这一酶法生产L-苯丙氨酸作了深入细致分析，对我国作出的国际性环境保护承诺，以及对我国氨基酸行业产业发展，当前调结构转方式，实现化工产品的绿色制造具有重要意义。
从中长期来看，肉桂酸/酶法生产苯丙氨酸具有市场竞争力，因为它是非粮途径酶法生产创新新工艺，符合我国氨基酸产业发展的国情。立项开发四氯化碳-肉桂酸-苯丙氨酸（医药级）路线，产品定位在替代进口医药级（大输液）苯丙氨酸产品是可行的。现行的100t/a级红酵母PAL/肉桂酸工业生产工艺已经证明是“技术可行-经济合理”的。本工艺在1998-2005期间，首次由国内3家民营企业，共计生产出了2000多吨苯丙氨酸（工业级）产品，是国内此前久攻不不的必需氨基酸产品，结束了长期依赖进口的局面。同期，由体制内拿了国家科技攻关项目的单位并未完成任务，反而由民营科技型企业，经由产学研合作，予以突破，致使得苯丙氨酸（工业级）产品，由1995年进口到岸价20万元/吨，逐步下降到2005年的5-6万元/吨，这就有效地推动了二肽甜味剂阿斯巴甜的产业发展。可见，不可忽视我国产业经济发展过程中民企的地位和作用。
