本报记者 张佳星
非洲猪瘟100%的致死率令养殖场措手不及，侵入猪身体里的病毒为什么可以长驱直入？有没有什么办法能够阻止它的入侵呢？
日前，我国复旦大学生命科学学院、遗传工程国家重点实验室甘建华课题组与李继喜课题组合作，研究解析了非洲猪瘟病毒DNA修复通路上一种关键酶的结构。相关研究成果在线发表于《自然·通讯》。 该研究用X-射线晶体学方法解析了AsfvDNAL与不同类型DNA复合物的结构，揭示了AsfvDNAL结合和催化底物连接的分子机制，为针对非洲猪瘟病毒DNA修复通路蛋白的药物设计提供了结构基础。
图1. AsfvDNAL与DNA底物复合物的晶体结构
ASFV病毒是一种独特的双链DNA病毒，既能感染野生猪，也能感染家猪。一旦爆发，将会导致近100%受感染猪的死亡。自1921年被发现以来，ASFV病毒受到了科研人员的广泛关注，但目前仍没有任何有效的疫苗被报道。ASFV病毒对全球多个国家和地区的猪饲养业都是一种巨大的威胁，并于2018年在中国首度爆发，导致了严重的经济损失。ASFV病毒编码了多个蛋白，形成了一套完整的DNA修复通路。与通常的DNA修复通路不同，ASFV DNA修复通路中的DNA 聚合酶（AsfvPolX）和连接酶AsfvDNAL的保真性都非常低，在ASFV病毒基因组的修复和突变过程中均发挥了关键作用。本团队早期研究发现，AsfvPolX拥有一个独特的磷酸根识别位点，对其底物结合和催化活性十分关键（Plos Biology, 2017）。
AsfvDNAL与同源蛋白的序列相似性很低，其容忍碱基错配的分子机制还不明确。针对上述问题，甘建华、李继喜和黄震团队利用晶体学手段，成功解析了AsfvDNAL与不同DNA底物的高分辨率结构(图1)。晶体结构显示，AsfvDNAL的N-端具有一个独特的DNA结合结构域（NTD），该结构域对底物结合十分重要。虽然AsfvDNAL与常见的DNA连接酶在催化机制方面保守，AsfvDNAL在底物催化位点附近具有一些明显不同的氨基酸组成。蛋白突变、体外DNA结合以及活性研究显示，催化位点附近的氨基酸对催化形式AsfvDNAL-DNA复合物的形成及活性至关重要。
这种关键酶是连接酶，被称为基因“针线”，用于将不同的DNA片段连接起来。这次通过解析非洲猪瘟病毒DNA连接酶的分子机制，研究团队找到了非洲猪瘟病毒的保守位点，为针对非洲猪瘟病毒DNA修复通路蛋白的药物设计提供了结构基础。
断尾求生，病毒躲过宿主免疫系统
“人们会发现，患了猪瘟的病猪会发生脾脏肿大，脾脏是重要的免疫器官，那说明它的免疫系统‘奋力作战’了。”李继喜说，但是非洲猪瘟病毒很聪明，在进入体内后会不断变化，让免疫系统“抓不到”。
它的变化很像壁虎的“断尾求生”。“对于宿主免疫系统要攻击的DNA片段，它会剪切掉，然后再重新‘长出来’。”李继喜说。“长出来”意味着DNA的延长、重组，这个过程需要两种DNA聚合酶(X和P)和一种DNA连接酶。
“有这3种酶参与的整个过程形成了一套完整的DNA修复通路。”李继喜说，团队已经解出了其中的一种聚合酶，文章2017年发表，揭示了聚合酶X拥有一个独特的磷酸根识别位点；另一种聚合酶的研究已经收尾，正在进行结果整理和论文编写工作，至此团队已经“全面打通”整个通路的关键节点。
病毒更狡猾的地方在于它新长出来的DNA片段和原来的不同，使得宿主体内的免疫系统措手不及，难以锁定攻击目标。非洲猪瘟病毒也是如此，其基因组修复时会发生突变，让免疫系统无法精准识别，进而使得针对它们的狙击，无法奏效。
分辨率高，晶体法定格“绣娘”手法
俗话说，“万变不离其宗”。既然病毒DNA修复时有千变万化，有没有可能找到所谓的“宗”即保守区呢？
这就要对关键酶进行高精度的结构解析。团队选择了X-射线晶体学方法，与声名鹊起的冷冻电镜方法相比，前者的分辨率更高，且一旦摸索好条件后，更易重复。
结晶条件的摸索却是非常艰难的过程。“我们用基因工程的方法，让非洲猪瘟病毒的连接酶在工程菌中大量表达，通过纯化柱等方法将蛋白纯化出来。”李继喜说。这个时候目标蛋白还在溶液中，与同自己性质、分子量相近的“兄弟姐妹”在一起。
团队进行了上千次相关参数的摸索，最终得到了均一性高的完美晶型，通过X光衍射、三维重构等方法，获得了分辨率达到2.5埃的连接酶分子结构。
在超高分辨率下，科学家可以看到蛋白质中每个氨基酸单体的相互作用、电子密度云的情况，目击氢键间的相互连接，从而判断和预测作为“绣娘”的DNA连接酶将用哪些可能的针法将什么样的DNA片段连接起来。
亲见“凹造型”，锁定药物设计潜力点
预测之后，必须亲见。利用X-射线晶体学方法获取酶与DNA作用的“影像”，将对酶与底物相互作用时的“凹造型”一目了然。
为此，根据已经获得的连接酶分子结构，参考相关文献，团队设计了10几种可能的DNA片段，试试连接酶的“功力”。“DNA片段有长有短，含有的碱基对数量8到20个不等。”李继喜说。
对于这些不同的DNA底物分子，连接酶表现了不同的活性。从本质上说，它们之间的反应是酶促反应。分析发现，非洲猪瘟病毒连接酶在底物催化位点附近具有一些明显不同的氨基酸组成。蛋白突变、体外DNA结合以及活性研究显示，催化位点附近的氨基酸对其与DNA形成复合物及活性至关重要。
李继喜解释道：“单独的酶的构象可以想象成一个三节棍，当和DNA作用时，这个三节棍的三段会发生变化，收拢到一起形成一个‘口袋’状，把DNA关在里面，促成DNA连接反应的进行。”
高分辨率结构显示，该连接酶在N-端具有一个独特的DNA结合结构域(NTD)，该结构域对底物结合十分重要。
“这就好比‘口袋’入口的地方有个把门的，这个独特的结合结构域‘认可’了，才能被连接酶纳入到口袋中，促进DNA的反应，如果这个‘把门’的不同意，就无法进行DNA的‘缝合’工作。”李继喜说。
可以针对这个独特的位点设计药物，阻断连接酶的工作，进而掌握抑制病毒的方法。“已有研究发现病毒的成熟颗粒中含有连接酶，也就是说病毒已经进入了宿主细胞，并进行了翻译和组装之后，才会启动连接酶的翻译工作。”李继喜说，因此以该位点为靶点的药物并不能预防非洲猪瘟的感染，而是对猪瘟进行治疗。目前，该团队已经开始与北大团队合作开启化合物的筛选工作。
