北京化工袁其朋团队等首次利用大肠杆菌生产戊二酸

       二羧酸是制造聚酯和聚酰胺的重要结构单元。由于对石油供应和环境保护的关注，人们越来越关注开发这些化学品的绿色和可持续途径。生物合成代表了一种很有前景的选择。目前，琥珀酸的生物生产已经足够成熟，可用于商业应用，重组谷氨酸棒杆菌的葡萄糖滴度达到152.2g/L-1。最近，通过逆转β-氧化途径实现了高滴度（68 g/L-1）和产率（0.38 g/g-1）的己二酸的生产。戊二酸是另一种重要的二羧酸，用于制造聚合物。脂肪族二羧酸中戊二酸的最低熔点可赋予所得聚合物独特的性能。此外，戊二酸是1,5-戊二醇的合成前体，一种常见的增塑剂和聚酯的前体。大肠杆菌是代谢工程的另一种常用宿主。然而，在过量产生赖氨酸的大肠杆菌菌株中重建AMV途径在摇瓶中仅产生0.82 g/L-1戊二酸，占理论产率的9.1％（0.75 mol/mol-1葡萄糖）。可能的原因是（1）途径具有阻止碳通量到达最终产物的未解决的限制因素和（2）下游途径的引入扰乱了现有的代谢平衡。

 

2019年7月26日，北京化工大学袁其朋教授联合孙新晓副教授在Nature Communications上发表题为“Targetingmetabolic driving and intermediate influx in lysine catabolism for high-levelglutarate production”的文章，首次利用大肠杆菌中赖氨酸的天然分解代谢机制进行戊二酸的生物合成，这项工作证明了代谢驱动对重新定向碳通量的能力以及转运蛋白对减少中间体积累的作用。
 

研究人员通过调节自身的基因，将大肠杆菌为有效的戊二酸生产者。从草酰乙酸中，完整途径涉及15个酶促步骤，这代表了实现增强和平衡表达的巨大挑战。驱动力对于目标化合物的有效生物合成是必不可少的。它们可以作为推动（例如，增加前体供应），拉动（例如，流出或除去最终产物）或内部循环泵（例如，氧化还原平衡）存在。在厌氧条件下，NADH经常用作内部循环泵，用于生产乳酸盐，琥珀酸盐，乙醇和1-丁醇。在有氧条件下，过度表达关键途径酶常被用作驱动力。然而，对于长途径，多基因的过度表达经常导致代谢负担，并且需要通过多变量模块优化等策略进行仔细平衡。

 

在分析了戊二酸生物合成途径后，研究人员发现可以利用至少三种不同的驱动力（谷氨酸的再循环，氧化还原能力的再循环和反馈抑制的释放）来连续推动碳通量通过目标途径。大肠杆菌尸胺途径涉及一次脱羧（CadA），两次转氨（PatA和GabT）和两次脱氢反应（PatD和GabD）。虽然它比AMV途径长一步，但是尸胺途径不需要分子氧的参与，这有利于大规模培养。此外，每消耗赖氨酸，转氨反应产生两个谷氨酸，脱氢酶分别产生两个NAD（P）H。有趣的是，从草酰乙酸开始，赖氨酸生物合成途径消耗两个谷氨酸和两个NAD（P）H以产生一个赖氨酸。因此，赖氨酸分解代谢可以补充谷氨酸和NAD（P）H用于赖氨酸生物合成。

 

大肠杆菌中戊二酸合成的天然途径

 

 

已经设计了各种生物合成途径来探索戊二酸的可持续生产，戊二酸是一种有吸引力的聚酯和聚酰胺的C5结构单元。然而，其在大肠杆菌中尚未实现其有效生产。因此在该研究中，使用大肠杆菌天然赖氨酸分解代谢机制进行戊二酸生物合成。这种内源性基因设计可以产生强大的代谢驱动力，通过补充谷氨酸和NAD（P）H进行赖氨酸生物合成，释放赖氨酸反馈抑制和促进草酰乙酸供应，从而最大化碳通量向戊二醛生物合成。使用天然转运蛋白来克服尸胺和5-氨基戊酸的细胞外积累。通过这些努力，在补料分批条件下实现了高滴度（54.5g L-1）和高产率（0.54mol mol -1葡萄糖）的戊二酸生产。这项工作证明了重定向碳通量的能力和转运蛋白减少中间积累的作用。


nature原文地址https://www.nature.com/articles/s41467-019-11289-4