近日，浙江大学的吴起团队、上海有机化学研究所的周佳海团队、英国贝尔法斯特女王大学的黄美兰团队、德国马普煤炭所的M.T. Reetz教授合作在Nature Communications 上发表论文，报道了人工改造高活性半胱氨酸脂肪酶的新突破。他们以南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）为基础，通过蛋白质工程将催化中心的丝氨酸改造为半胱氨酸，以此为基础构建了半胱氨酸脂肪酶。为了获得高活性的突变体，研究人员采取理性设计的迭代突变策略，选取催化空腔周围的三组关键氨基酸残基，利用定点突变的方法依次改造为若干不同侧链大小的氨基酸并选取其中最好的突变体继续下一轮筛选。相比饱和突变，这一策略可以在省去数倍的工作量同时获取最优的突变体。最终研究人员成功筛选得到了能够高效催化苯甲酸酯水解的半胱氨酸脂肪酶QW4。与野生型相比，QW4的催化效率提高了40倍，而且对类似的底物都具有较高的催化活性。
图1、通过定向进化将丝氨酸脂肪酶改造为高活性的半胱氨酸脂肪酶
为了探明QW4催化效率提升的分子机制，并研究脂肪酶活性位点的亲核基团变化对催化过程的影响，研究人员保留QW4中的其他突变位点，将半胱氨酸突变回丝氨酸，得到对应的丝氨酸突变体QW10。并采用晶体学方法获取了QW4与QW10的蛋白晶体结构，进一步通过分子对接和MD模拟，将其与野生型CALB的结构进行对比，逐个分析突变位点在催化过程中所起的作用。分析表明，突变的氨基酸残基可以扩大空腔体积、提高与底物的适配度、增加入口处的灵活性，整体降低了苯甲酸对硝基苯酚酯这样的大基团底物进入催化位点的难度，从而提高催化活性。
图2、野生型CALB（c & 灰色）、QW4（a & 绿色）和QW10突变株（b & 红色）的晶体结构对比
研究人员进一步采用QM/MM计算方法探讨了丝氨酸脂肪酶和半胱氨酸脂肪酶突变体的催化机理。计算结果显示，两者的活性位点亲核基团进攻生成酶-酰基复合物的过程存在显著的不同。丝氨酸突变体QW10在催化中羟基氧的氢离子解离与亲核进攻同时发生，只有一个过渡态能垒，为协同反应机理。而在半胱氨酸突变体QW4中该过程产生变化，表现为分步反应机理，巯基上的氢先解离，形成较稳定的HisH+/CysS-离子对中间体，再由S负离子作为亲核供体进攻羰基C形成酶-酰基复合物。
图3、CALB的丝氨酸突变体QW10（a，c）和半胱氨酸突变体QW4（b，d）不同的催化反应机理
这是第一次成功改造脂肪酶催化中心的亲核基团获取具有较高活性的人工酶，创造了一种自然界并不存在的、具有高活性的半胱氨酸脂肪酶，并采用结构生物学及计算化学方法,从分子层面揭示了催化活性提升的原理，发现了丝氨酸脂肪酶和半胱氨酸脂肪酶不同的亲核反应机制。该工作成果为未来新型水解酶等蛋白质工程改造提供了新思路，在人工酶设计、水解酶催化机理的认识中具有重要的科学意义。
该文章的第一作者是浙江大学化学系的博士生岑一欣。黄美兰博士、周佳海研究员、吴起副教授和Manfred T. Reetz教授为共同通讯作者。
