在微生物中异位重构植物天然产物的原生合成途径来合成这些化合物具有很好的前景。然而，松柏醇的原生合成途径涉及到至少8种异源基因，且其中包括2种细胞色素cP450酶编码基因，这些基因在原核微生物中很难表达出有活性的蛋白。尽管对其原生途径进行再设计可以避免细胞色素cP450酶，但是该途径依然比较复杂。莽草酸途径为松柏醇的合成提供前体，然而，在微生物中莽草酸途径受到严格的调控。在此前的研究中，通过在微生物中重构松柏醇的从头合成途径，Chen等合成了124.9 mg∙L-1松柏醇。然而，这距离能够商业化生产依然遥远。因此，通过生物转化法将廉价的底物高效的转化为松柏醇，相对于化学合成和微生物从头合成具有明显的优势。
丁香酚是一种廉价的植物天然产物(约5美元/公斤)，常被用于食品和化妆品工业中。来源于Penicillium simplicissimum的香草醇氧化酶(PsVAO)能够氧化一系列的对位替代酚。PsVAO能够将丁香酚氧化为松柏醇，同时产生等摩尔的副产物H2O2。尽管大肠杆菌内源的过氧化氢酶和过氧化物酶能够自主清除H2O2，然而，H2O2的快速积累显然能够超出这种自主清除能力的范围。过量H2O2的积累会导致PsVAO活性抑制和对宿主细胞的毒性。而且，H2O2是过氧化物酶催化的松柏醇聚合反应中的电子受体，在过量H2O2存在的情况下，微生物内源的过氧化物酶能够将松柏醇氧化为木质素。因此，将H2O2及时的从反应体系中清除出去，不仅能够保护PsVAO，而且能防止松柏醇的消耗。
PsVAO是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)蛋白，其活性依赖于FAD。使用全细胞催化能够为PsVAO提供FAD，并实现FAD的再生。强化胞内过氧化物酶活性，能够提高反应体系清除H2O2的能力，从而保护PsVAO的活性，且防止松柏醇的过度氧化(图1)。在本研究中，我们筛选了不同来源的过氧化氢酶，将具有高过氧化氢酶活性且低过氧化物酶活性的酶引入到反应体系中。结果表明，通过保护PsVAO的活性且防止松柏醇的过度氧化，提高了该反应体系的转化效率。通过反应条件优化，松柏醇的产量、转化率和生产强度分别达到22.9 g∙L-1、78.7%和0.5 g∙L-1∙h-1。
1过氧化氢对PsVAO的抑制及松柏醇的过度氧化作用
尽管H2O2分布于几乎所有细胞生物中，然而它的过度积累能产生有害作用，如抑制酶活性等。通过将PsVAO与不同浓度的H2O2共同孵育分析H2O2对PsVAO活性的抑制。结果表明，当H2O2浓度超过20 μM时，PsVAO的活性显著下降(图2)。尽管多余的H2O2通常能够被运输到细胞外，但是其快速生成依然可以导致其在宿主细胞中的积累。在过氧化物酶催化的松柏醇聚合反应中，H2O2作为电子受体能够驱动该反应的正向进行。松脂素为松柏醇氧化反应的二聚体，可以作为松柏醇过度氧化的标志。如图2所示，当H2O2的浓度低于10 μM时，反应体系不能检测到松脂素；在H2O2的浓度从10 μM增加到5000 μM的过程中，松脂素的产量不断增加。该结果表明，过量的H2O2导致松柏醇的过度氧化。
作为依赖于辅因子的蛋白，PsVAO更适于用来构建全细胞催化。然而，PsVAO产生的副产物H2O2能够反馈抑制PsVAO的活性，且对宿主细胞有害。此外，大肠杆菌内源的过氧化物酶能够利用H2O2作为电子受体氧化松柏醇。为了防止松柏醇的过度氧化，可以采取两种方法。第一种方法是敲除大肠杆菌内源的过氧化物酶。然而，这会导致大肠杆菌清除胞内活性氧的能力下降，胞内活性氧的积累对于宿主细胞和酶活有害。况且，大肠杆菌含有多拷贝的过氧化物酶基因，要将这些基因全部敲除并不容易。第二种方法是清除反应体系中的H2O2。过氧化氢酶能够将H2O2降解为H2O和O2，从而防止松柏醇的过度氧化和对PsVAO活性的抑制。然而，需要注意的是，一部分微生物过氧化氢酶具有过氧化氢酶和过氧化物酶的双重活性，而过氧化物酶的活性是显然需要避免的。因此，本研究的关键在于筛选没有过氧化物酶活性的过氧化氢酶。
2过氧化氢酶的表达与分析
为了筛选在最优反应条件下具有活性的过氧化氢酶，首先对松柏醇的最优合成反应条件进行分析。结果表明，利用PsVAO将丁香酚转化为松柏醇的最优pH和温度分别为9.0和45oC。从微生物基因组DNA中扩增相应的过氧化氢酶基因，这些基因的NCBI注册号分别为：BsCATCP020102.1、PpCATLT799039.1、SaCATCP023391.1、EcCATCP020368.1、ScCTA1CP020160.1和ScCTT1CP020129.1。使用pET28a(PB)在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达这些基因，重组过氧化氢酶的表达使用SDS-PAGE进行分析。结果表明，来源于Bacillus subtilissubsp. subtilis str. 168 (BsCAT)、Pseudomonas putidaKT2440 (PpCAT)、Staphylococcus aureussubsp. aureus NCTC 8325 (SaCAT)、E. coliBL21 (DE3) (EcCAT)和Saccharomyces cerevisiaeS288C (ScCTA1)的过氧化氢酶均实现了可溶性表达，未检测到来源于Saccharomyces cerevisiaeS288C的ScCTT1的可溶性表达。将这些可溶性表达的蛋白，在最优的松柏醇合成反应条件下进行过氧化氢酶活性分析。结果表明，BsCAT、EcCAT和ScCTA1具有显著的过氧化氢酶活性(图3)。为了分析这些酶是否具有过氧化物酶活性，使用ABTS法对这些没进行了分析。结果表明，除SaCAT外，这些过氧化氢酶均没有过氧化物酶活性。因此，BsCAT、EcCAT和ScCTA1被用于强化反应体系中的过氧化氢酶活性。
3强化过氧化氢酶活性的松柏醇合成体系的构建与分析
为了保护PsVAO活性及防止松柏醇过度氧化，需要防止反应体系中H2O2的过度积累。通过强化反应体系中过氧化氢酶活性可以实现反应体系中H2O2的原位消除。使用ePathBrick方法将PsVAO与过氧化氢酶组装为单顺反子结构。结果表明，本研究所用的一系列过氧化氢酶可以实现H2O2含量调节效果(图4A)。在没有过氧化氢酶的情况下，反应体系在2小时内积累了42.7 μM H2O2。在胞内H2O2含量最低的反应中，松柏醇的产量最高，同时产生的松脂素最少(图4B)。其中最优菌株strVAOSc (strPsVAO中含有ScCTA1)被用于转化条件的优化。
PsVAO可以转化一系列的对位取代酚，其中包括将丁香酚转化为松柏醇。然而，该过程中H2O2的快速积累导致对PsVAO的反馈抑制和产物的过度氧化。本章结果表明，通过强化反应体系中的过氧化氢酶活性能够解决上述PsVAO催化反应的问题，从而提高松柏醇的合成效率。而且该方法也可应用于香草醇氧化酶催化的其他反应。
4条件优化及3-L发酵罐发酵
在最优反应条件下，将松柏醇的合成反应在3 L发酵罐中进行了1.5 L规模的验证。每2小时向反应体系中添加0.5% (v/v，或5.3 g∙L-1)丁香酚，共计2.5% (v/v，或26.5 g∙L-1)的丁香酚被用作底物。结果表明，在45oC条件下，松柏醇的转化率显著下降。因此，在接下来的转化中将反应温度调整为37oC。该反应条件下，松柏醇的产量为22.9 g∙L-1，转化率和生产强度分别为78.7%和0.5 g∙L-1∙h-1(图5)。相对于空白对照，强化反应体系中的过氧化氢酶活性能够将松柏醇的产量和转化率提高80.1% (图5)。在转化过程中，能够观察到反应体系中的松柏醇沉淀。进一步详细的条件优化可能使松柏醇的产量和转化率进一步提高。将松柏醇从反应体系中原位分离也是防止其过度氧化的有效方法。使用乙酸乙酯提取反应体系中的松柏醇，经快速柱色谱纯化，得到白色固体产物。经HPLC分析，该产物的纯度为96.2%，回收率为75.5%。所得产物经LCMS-IT-TOF和NMR鉴定为松柏醇(图6)。
反应体积为1.5 L，在37oC条件下，每2小时补加0.5% (v/v，或5.3 g∙L-1)丁香酚。
在自然界中，松柏醇经苯丙素途径合成，且存在于大多数植物中。然而，其含量通常较低，这使得分离纯化较为困难。另一方面，化学合成法需要使用昂贵的底物和催化剂，且反应条件苛刻。近来，Chen等在大肠杆菌中构建了单体木质醇的从头合成途径。尽管对单体木质醇的原生合成途径进行了优化和再设计，重构其从头合成途径依然需要使用至少6个外源基因。该从头合成途径是大肠杆菌内源L-酪氨酸的延伸。由于大肠杆菌莽草酸途径受到严格的调控，其过量合成L-酪氨酸并不容易。经过优化，重组菌株合成了124.9 mg∙L-1松柏醇。相对于从头合成，本章所构建的生物转化法在产量和生产强度上具有明显的优势。
本文以“Improving bioconversion of eugenol to coniferyl alcohol byin situeliminating harmful H2O2”为题发表于“Bioresource Technology”期刊，国工吕永坤为第一作者，周景文教授为通讯作者。这一研究受到了国家重点研发计划项目（No. 2017YFC1600403）、国家自然科学基金（31670095, 31770097）和国家轻工技术与工程一流学科（LITE2018-08）支持。
代表性图表
图1 分别由PsVAO和PsVAO-过氧化氢酶催化的松柏醇合成反应
A：由PsVAO催化的松柏醇合成反应。PsVAO催化的松柏醇的合成反应产生过量的H2O2，导致PsVAO活性抑制和松柏醇的过度氧化。虚线表示在过量H2O2存在的情况下过氧化物酶催化松柏醇的聚合反应。B：由PsVAO-过氧化氢酶催化的松柏醇合成反应。过氧化氢酶将H2O2分解为H2O和O2，实现O2的循环利用，且避免了PsVAO活性抑制和松柏醇的过度氧化。
图2 H2O2对PsVAO活性的抑制及松柏醇过度氧化分析
将PsVAO与不同浓度的H2O2共同孵育，并测定PsVAO的活性。每单位PsVAO的活性定义为1小时内产生1 mmol∙L-1松柏醇。
图3 过氧化氢酶活性分析
每单位过氧化氢酶活性被定义为在45oC、pH9.0条件下1分钟分解1 μM H2O2。通过将过氧化氢酶活性除以蛋白质浓度对过氧化氢酶活性进行归一化。
图4 强化反应体系过氧化氢酶活性效果分析
A：不同重组菌株催化的反应体系中H2O2含量。B：不同菌株的松柏醇和松脂素产量及转化率。
图5 3 L发酵罐中的松柏醇合成反应
图6 纯化产物离子阱飞行时间质谱和NMR鉴定结果
A：纯化产物的离子阱飞行时间质谱鉴定结果。179.0734m/z为负离子模式下松柏醇的质谱峰。B：纯化产物的NMR鉴定结果。1H NMR (400 MHz, MeOD) δ = 7.01 (d,J= 1.5 Hz, 1H), 6.86 (dd,J= 8.1, 1.8 Hz, 1H), 6.75 (d,J= 8.1 Hz, 1H), 6.52 (d,J= 15.8 Hz, 1H), 6.21 (m, 1H), 4.21 (dd,J= 5.9, 1.3 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H).参考数据：Ralph and Zhang, 1998。
