江南大学刘立明实验室发表在Microbial biotechnology上的一篇Chassis engineering of Escherichia coli fortrans-4-hydroxy-L-proline production，通过改造大肠杆菌实现全细胞催化将L-脯氨酸转化为trans-4Hyp。
脯氨酸4-羟化酶（trans-prolyl-4-hydroxylases，P4H）在α-酮戊二酸（a-ketoglutarate，α-KG），氧气和亚铁的存在下，可以催化L-脯氨酸在第4位的羟化反应，生成trans-4Hyp。首先，研究人员选择了4种P4H，通过全细胞生物催化实验发现来自孢囊菌属RH1的DsP4H活性最高，过表达DsP4H的大肠杆菌菌株在α-KG的存在在可将50 g/L L-脯氨酸转化为32.5 g/L trans-4Hyp，摩尔转化率为57.1%，然而这个催化过程需要额外提供α-KG。
在大肠杆菌的TCA循环中从α-KG到琥珀酸需要α-KG脱氢酶复合体和琥珀酰-CoA合酶（sucCD）依次催化，而P4H可以通过一步实现从α-KG到琥珀酸的转化（图1）。为了在不添加α-酮戊二酸的条件下生产trans-4Hyp，研究人员在大肠杆菌中同时敲除编码琥珀酰-CoA合酶的sucC和sucD，在P4H的驱动下，α-KG节点处的通量分配可定向到trans-4Hyp的合成，随后，研究人员又敲除了编码脯氨酸脱氢酶的putA以减少L-脯氨酸的降解，得到的菌株在不添加α-KG的催化反应中，trans-4Hyp对L-脯氨酸的摩尔转化率达到了72.5%。最后，研究人员通过微调透明红颤菌血红蛋白的表达改善氧传质，最终工程菌株E. coli∆sucCD∆putA-VHb(L)-DsP4H的产量，摩尔转化率和生产率得到显著提高，分别是49.8 g/L，87.4%和1.38 g/L/h。
图1将P4H与代谢途径结合实现trans-4Hyp酶促生产
江南大学饶志明实验室发表在Science Advances上的一篇“Significantly enhancingproduction of trans-4-hydroxy-l-proline by integrated system engineering in Escherichia coli”，用发酵法生产trans-4Hyp。首先通过稀有密码子筛选获得了大肠杆菌M1，可产18.2 g/L L-脯氨酸。随后，在M1菌株的基础上通过代谢工程改造敲除基因putA，proP（H+/proline同向转运蛋白），putP（Na+/proline同向转运蛋白）和aceA（异柠檬酸裂解酶），对proB（谷氨酸激酶）基因进行突变获得菌株M6（图2），将代谢流导向L-脯氨酸的生产并解除反馈抑制，该菌株可产生15.7g/L trans-4Hyp，同时也产生了10g/L L-脯氨酸。为了进一步提高trans-4Hyp的产量，需要抑制α-KG脱氢酶（α-KG dehydrogenase，ODHC）的酶活为其提供更多的α-KG，但是敲除ODHC阻止TCA循环可能会影响细胞生长，于是，作者基于群体感应动态调控ODHC的活性，产生了43.2 g/Ltrans-4Hyp，同时产L-脯氨酸4.3 g/L。最后，利用理性设计的L-脯氨酸羟化酶，在60 h内几乎未产生脯氨酸，trans-4Hyp产量为54.8 g/L，葡萄糖转化率为0.236 g/g葡萄糖，生产率为0.91 g/L/h。
图2 L-脯氨酸代谢工程改造示意图
天工所孙际宾实验室在2018年发表在Journal of Bioscience and Bioengineering上的一篇“Efficient production of trans-4-hydroxy-L-proline from glucose using a newtrans-proline 4-hydroxylase in Escherichia coli”也是通过发酵法产trans-4Hyp。通过基因组挖掘新的P4H并在生产脯氨酸的大肠杆菌中过表达，实现了trans-4Hyp的高产。
综上，有两条路线产trans-4Hyp。1、催化法：以L-脯氨酸为底物，刘立明实验室通过组合策略，首先筛选最优的P4H，随后利用P4H可转化α-KG为琥珀酸的特性，敲除TCA循环中的琥珀酰-CoA合酶，将α-KG通量导向P4H合成，最后微调透明红颤菌血红蛋白表达改善氧传质，实现trans-4Hyp生产力的提升；2、发酵法首先要获得高产L-脯氨酸的菌株。饶志明实验室多种策略结合，首先通过稀有密码子筛选获得脯氨酸高产菌株，随后改造L-脯氨酸生产的重要靶点进一步提高脯氨酸的产量；孙际宾实验室是以一株高产L-脯氨酸的菌种为出发菌株；然后饶志明实验室利用基于群体感应动态调控α-KG脱氢酶的酶活，最后利用理性改造的P4H进一步提高了trans-4Hyp的生产力；孙际宾实验室通过基因组挖掘新的P4H并过表达实现了trans-4Hyp的高产。上述三篇文章的改造策略都为trans-4Hyp的生产提供了重要的技术指导，具有应用潜力。
