关键词：新冠肺炎，新型冠状病毒SARS-CoV-2，抗病毒，传统彝药，发酵液
研究背景
新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）是由新冠病毒SARS-CoV-2引起的急性呼吸道传染病。患者主要症状为发热，乏力，干咳，鼻塞，流涕等，上呼吸道感染症状较少见。约半数的患者在一周后可出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。SARS-CoV-2属于β属的冠状病毒,有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径60-140nm。根据美国约翰·霍普金斯大学发布的新冠疫情最新统计数据，新冠病毒已经导致全球8000多万人感染，170多万人死亡。疫情导致很多国家关闭了企业和学校，对全球经济造成严重破坏。目前，瑞德西韦已经被FDA批准用于新冠治疗，但是WHO宣称，瑞德西韦对新冠肺炎几乎无效。疫苗的研发取得了较大的进展，但安全有效的疫苗在临床上广泛使用，至少还需要数月的时间。
目前，新冠疫情在中国已经很好地控制，在这个过程中，中医药做出了巨大贡献。如莲花清瘟胶囊和藿香正气水，能显著改善新冠引起的发烧、咳嗽、咳痰和呼吸困难等症状。然而，目前仍然没有治疗新冠的特效药。因此，发现能显著抑制新冠病毒复制的药物，对新冠疫情防控至关重要。
彝医药是中国传统医药的重要组成部分，对中华文明的发展做出了巨大贡献，其中世界著名的云南白药，就是来源于彝族医药。解本10号是一款基于传统彝族医药理论，用余甘子、刺梨、柠檬、核桃和蜂蜜共发酵得到的中药发酵液。前期，我们在筛选抗新冠病毒候选药物的过程中，发现了解本10号能显著抑制新冠病毒的复制。进一步的研究表明，解本10号具有良好的抗氧化和抗炎功效。本研究将为COVID-19提供了一种潜在的治疗策略。
结果
体外抗新冠病毒（SARS-CoV-2）活性研究
使用CCK-8试剂盒评价解本10号对Vero E6细胞的体外毒性作用。从图1可以看出，解本10号在浓度超过100倍稀释时，对Vero E6细胞没有明显毒性损伤。半数毒性浓度CC50为稀释18.02倍。根据以上结果，将解本10号稀释100倍以上，进行抗病毒活性实验室。实验步骤根据Wang等报道的方法略作修改，将Vero E6细胞以0.05的感染倍数（MOI）用SARS-CoV-2进行感染，然后用不同浓度的解本10号（稀释至100、200、400、800、1600和3200倍）下处理感染后的细胞，通过实时定量RT-PCR（qRT-PCR）检测细胞上清中病毒的拷贝数，评价病毒的复制情况。如图1所示，解本10号对SARS-CoV-2具有很强的抑制作用半数有效浓度EC50为稀释769.1倍，选择指数为42.68。这些结果表明解本10号具有开成为COVID-19治疗的候选药物的潜力。
（图1：解本10号对SARS-CoV-2的体外抑制活性）
将SARS-CoV-2以0.05的MOI感染Vero E6细胞，在不同剂量的解本10号发酵液中培养24 h，用qRT-PCR法测定细胞上清液中病毒含量。用CCK-8法测定解本10号发酵液对Vero E6细胞的毒性。
抗氧化活性研究
以活性氧（ROS）水平过高为特征的氧化应激在COVID-19的进展中起着至关重要的作用。许多证据表明，用抗氧化剂对ROS进行调节，可以防止COVID-19恶化。研究者们用二苯代苦味酰基自由基体系(DPPH·)和羟基自由基体系(·OH)对某解本10号的体外清除自由基能力进行了研究。如图2A所示，解本10号表现出非常强的DPPH自由基清除活性。当解本10号稀释至800倍、1600倍、6400倍和12800倍时，DPPH自由基去除率分别为82.99%、65.23%、53.09%和25.84%。从图2B可以看出，解本10号还表现出较强的羟自由基清除活性。稀释至20倍、30倍、40倍和50倍后，羟基自由基的去除率分别为67.42%、59.92%、53.91%和51.64%。
（图2：DPPH自由基和羟自由基的清除活性研究）
A. 解本10号稀释 800、1600、6400和12800倍
B. 解本10号稀释 20、30、40和 50倍
抗炎活性研究
细胞因子风暴和过度肺部炎症，是导致COVID-19感染者病情严重和死亡的重要原因。据报道，控制COVID-19的局部和全身炎症反应可能与抗病毒治疗一样重要。解本10号的抗炎活性根据Liu 等报道的方法进行测定。在抗炎实验开始前，用MTT法检测解本10号对RAW264.7细胞株的毒性。如图3A所示，解本发酵液稀释160倍以上，对RAW264.7细胞没有明显毒性。 用稀释500、1000、2000、4000、8000和16000倍的发酵液，处理LPS诱导的RAW264.7细胞，检测细胞分泌NO的情况，评价解本10号的抗炎活性。从图3B可以看出，解本10号可有效地抑制NO的产生。当解本10号稀释至2000倍时，NO抑制率仍接近80%。这些结果表明解本10号具有很强的抗炎活性。
（图3.：解本10号的抗炎活性）
A.解本10号对RAW 264.7细胞的毒性；B.解本10号抑制NO的生成
活性成分分析
由于解本10号具有较强的抗新冠病毒活性、抗氧化活性和抗炎活性，我们对其成分进行了分析，为解本10号的作用机制提供依据。由表1可知，解本10号含有维生素C、SOD、黄酮、多酚、粗多糖、原花青素、皂苷、香豆素等多种活性成分，而这些物质具有抗氧化、抗炎、调节免疫、抗病毒等作用。
讨论
中医药有近3000年的历史，在中国广泛应用。中国历史上发生过几次流行病，但幸运的是，没有发生大量伤亡，部分原因是使用了中医药。彝族传统医学是中医学的重要组成部分，有其独特的医学理论和实践经验。解本10号是以余甘子、刺梨、柠檬、核桃、蜂蜜为原料，按照彝族传统医学理论配伍，经发酵得到的发酵液。本文对解本10号抗新冠病毒SARS-CoV-2的活性进行了研究。我们发现解本10号具有显著的抗病毒活性。氧化应激和炎症在COVID-19的进展中起重要作用。因此，我们还探索了解本10号的抗炎和抗氧化活性。结果表明，解本10号具有较强的抗炎和抗氧化作用。
解本10号含有大量的维生素C、SOD、黄酮、多酚、粗多糖、原花青素、皂苷、香豆素等。维生素C具有抗病毒、抗氧化、抗炎、免疫调节等多种药理作用，是治疗COVID-19的一种潜在选择。SOD是一种活性很强的抗氧化剂，在对抗自由基损伤和炎症方面发挥着重要作用，此外SOD可能具有抗衰老作用。而衰老相关的炎症可能加重COVID-19。因此，SOD可能有利于COVID-19的治疗。研究表明，黄酮类化合物能抑制冠状病毒感染周期中的关键蛋白和SARS-CoV蛋白酶PLpro和3CLpro。黄酮类化合物对SARS-CoV的核苷三磷酸水解酶（NTPase）/解旋酶和N蛋白也有抑制作用。而解本10号中总黄酮含量高，这可能与我们观察到的病毒复制的抑制作用有关。多酚是自然界中一类重要的生物活性化合物，具有抗病毒和多种功效。研究表明，多酚被证明能抑制SARS-CoV-2融合/进入，破坏SARS-CoV-2复制，抑制宿主炎症反应。从表1可以看出，解本10号中的多酚含量丰富，这可能对解本10号的抗病毒活性有贡献。多糖具有良好的安全性、免疫调节性和抗病毒活性，在抗病毒尤其是抗冠状病毒方面有着广泛的应用。Song等人发现多糖对SARS-CoV-2具有很强的抑制活性。进一步的研究表明，多糖能与S糖蛋白结合，阻止SARS-CoV-2进入宿主细胞。Zhu等用SARS-Cov-2的主要蛋白酶（Mpro，3CLpro）筛选植物黄烷-3-醇和原花青素。结果表明，原花青素能抑制SARS-Cov-2的3CLpro活性。解本10号中高含量的原花青素也可能有助于抑制SARS-Cov-2的复制。计算机模拟研究表明，皂甙衍生物对SARS-CoV-2的类木瓜蛋白酶具有很高的结合亲和力。分子对接分析还表明，天然香豆素类似物飞龙掌血香豆醌对COVID-19的3CLpro有显著的抑制作用（与复合物α-酮酰胺相比（PDBID:5N5O）），结合能为-7.8kcal/mol。合成的香豆素类似物（1m）也表现出相当的抑制能力，COVID-19（含α-酮酰胺）与3CLpro的结合能为-7.1 kcal/mol。解本10号含有大量的香豆素，这可能有助于抑制病毒的复制。
总之，鉴于全球新冠肺炎流行的紧迫性，这种安全廉价的发酵液可能有助于预防或治疗COVID-19。我们的数据支持解本10号进入临床阶段，进一步验证其抗SARS-CoV-2感染和治疗的有效性。
材料和方法
材料
Vero E6细胞系和小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自ATCC。Vero E6细胞用高糖DMEM培养基（Gibco 41966-029）培养，培养基含10%（v/v）FBS、1%的青霉素和链霉素。RAW264.7细胞用DMEM培养，培养基含10%（v/v）FBS、1%的青霉素和链霉素。281 SARS-CoV-2毒株由深圳市疾病预防控制中心保存。用TCID50滴定法测定病毒滴度。解本10号发酵液，贵州金黔果生物科技有限公司提供，脂多糖（LPS）、MTT、硫酸亚铁和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）均购自西格玛奥德里奇，水杨酸购自百灵威科技有限公司，一氧化氮检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
体外抗病毒活性
Vero E6细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板。将SARS-CoV-2以0.05的MOI感染细胞2h，用不同剂量的解本10号处理感染的细胞24h，用qRT-PCR法测定细胞上清液中病毒产量。解本10号对Vero E6细胞的细胞毒性通过CCK8试剂盒测定。将细胞接种于96孔板（5×103细胞/孔）中，培养过夜。解本10号用培养基稀释至10倍、20倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1600倍和3200倍，再与细胞孵育48小时，加入CCK8，再孵育4小时，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。实验至少重复3次。
抗氧化活性
采用DPPH自由基清除试验和羟自由基清除试验对解本10号的抗氧化活性进行评价。对于DPPH自由基清除试验，将200微升样品和2 ml 400μL DPPH溶液（溶解于70%乙醇溶液中）在室温下反应1 h。在517 nm处用含有DPPH和70%乙醇溶液的空白测量吸光度。DPPH自由基清除率（%）的计算公式如下：
其中，A0是空白对照的吸光度值，A是样品的吸光度值。
在羟自由基清除活性测定中，将250μL硫酸亚铁溶液（2 mM）、250μL水杨酸溶液（2 mM）和100μL样品充分混合。加入250微升过氧化氢溶液（0.01%），反应混合物在37℃搅拌30分钟。冷却后在510nm处测定吸光度。羟自由基清除率（%）按下式计算：
其中，Z0是空白对照的吸光度值，Zi是样品的吸光度值，Zi0是H2O2的吸光度值，不含显色剂。
抗炎活性
在抗炎活性实验开始前，检测解本10号对RAW264.7细胞株的细胞毒性。将RAW264.7接种到96孔板中。培养过夜后，用含有梯度浓度（稀释至0、20、40、80、160、320、640和1280倍）解本10号的新鲜培养基替换原培养基，每个浓度三个复孔。处理24h后，MTT法测定细胞活力。解本10号的抗炎活性根据Liu等人的方法进行。将RAW264.7细胞按照密度为1×105个细胞/孔置于24孔培养板中，培养过夜。用0.5 ml含有不同浓度解本10号的新鲜培养基替换原培养基，每个浓度三个复孔。孵育1h后，每孔加入含LPS的50μL培养基，使LPS的最终浓度为1μg/mL。培养18小时后，将100μL上清液放入另一个96孔板中，然后在540nm处测量样品的吸光度。用亚硝酸钠标准曲线计算NO含量。NO产生的抑制率按抑制率（%）=100×（CODSOD）/COD计算。式中，COD为对照组的光密度，SOD为样品的光密度。IC50值定义为亚硝酸盐自由基减少50%的浓度。
活性成分分析
活性成分由中国食品发酵工业研究院根据相关标准测定。
供稿：深圳市疾病预防控制中心；四川大学；南京中医药大学
