β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononucleotide，NMN)是一种核苷酸化合物，是辅酶NAD+的前体。最近研究表明，NMN可以改善糖尿病和血管功能障碍，因此作为一种营养品引起了人们的关注。目前，微生物法生产NMN产率低，因此NMN常通过化学合成或生物酶法生产，但需要添加昂贵的底物和催化剂。在人细胞中，NMN主要由NAD+补救途径中的烟酰胺磷酸核糖基转移酶催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成。
2020年11月，来自日本神户大学的Akihiko Kondo等人利用大肠杆菌开发了一种全细胞生物催化器，它可以从廉价的原料底物葡萄糖和烟酰胺中选择性高产NMN。在《metabolic Engineering》（工程技术1区，IF=7.263）发表了题为“metabolic design for selective production of nicotinamide mononucleotide from glucose and nicotinamide”的研究论文，在这篇文章中，作者筛选并引入多种转运蛋白，如烟酸转运蛋白NiaP、烟酰胺核苷转运蛋白PnuC和来源于Chitinophaga Pinensis的高活性烟酰胺磷酸核糖基转移酶，使得大肠杆菌成为细胞代谢工厂，一边通过运输蛋白摄取烟酰胺，一边将合成的NMN排除胞外。此外，使用质粒表达磷酸核糖焦磷酸生物合成途径和优化单个基因表达使得NMN的产量达到6.79 g/l，提高烟酰胺到NMN的选择性至86%。本文为利用微生物进行低成本、高质量的NMN和其他核苷酸化合物的工业生产将很有前途。
所用到的主要方法
METHODS
1.高效液相色谱检测法HPLC
2.SDS-PAGE电泳
3.蛋白质诱导表达
4.比色分析试剂盒测酶活
高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，又称高效液相层析，简称HPLC）
基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。选择色谱分离方法的主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。
特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化
HPLC的操作步骤：
1、打开计算机和LC各模块电源
2、把流动相放入溶剂瓶中，手动旋开冲洗阀，进行脱气操作。
3、数据采集方法编辑（包括泵、自动进样器、柱温箱、检测器等参数设定）
4、等仪器准备好，基线平稳，运行方法。
5、数据分析方法编辑（从“视图”菜单中，点击“数据分析”进入数据分析画面。）
6、关闭计算机和 LC 各模块电源。
注意事项：
1、流动相过滤后用超声除去气泡。
2、运行方法前，应用流动相冲洗色谱柱至基线平稳。关机前，应用流动相冲洗色谱柱至基线平稳，防止色谱柱堵塞。
3、注意色谱柱PH范围，不能注射强酸强碱的样品。
SDS-PAGE电泳
基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。而SDS-PAGE根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
注意事项：
1、SDS与蛋白质的结合按质量成比例蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。
文章主要内容摘要
ABSTRACT
β-烟酰胺单核苷酸（NMN）是核苷酸化合物之一，是NAD +的前体，最近作为营养物质引起了人们的关注。因此，本文开发了一种使用大肠杆菌的全细胞生物催化剂，该催化剂能够从廉价的原料底物葡萄糖和烟酰胺（Nam）中选择性有效地高产NMN。值得注意的是，本研究确定了两个具有主动功能的转运蛋白（NiaP和PnuC）和一个高活性的关键酶（Nampt），允许细胞内Nam摄取，磷酸核糖焦磷酸（PRPP；由葡萄糖提供）和Nam高效转化为NMN，并在细胞外排NMN。此外，增强PRPP生物合成途径和优化单个基因表达使NMN的产量比迄今为止报道的要高得多。该菌株从葡萄糖和Nam胞外产生6.79g/1 NMN，并且从Nam到NMN的反应选择性为86％。本研究的方法对于利用微生物进行低成本，高质量的NMN和其他核苷酸化合物的工业生产将很有前途。
