生物法合成食品香料的研究进展

谷氨酸钠是谷氨酸的钠盐，是日常生活中调味品味精的主成分。2013年，谷氨酸钠的产量达到296万吨^[2]。1907年，日本东京帝国大学Ikeda发现海带的鲜味主要来源于谷氨酸钠。1908年，他通过采用盐酸水解植物蛋白的方法首次人工合成了谷氨酸钠，并申请了相关的专利^[3]。1909年，他与商人Suzuki合作，实现了谷氨酸钠的商品化生产，并将其命名为AJI-NO-MOTO，即味之素。

1956年，日本东京大学Asai^[4]和日本协和发酵公司Kinoshita^[5]发现，以产谷氨酸小球菌(现为谷氨酸棒状杆菌^[6]) 为生产菌种，通过糖和尿素等的发酵，以较高的产率得到了左旋谷氨酸产物。到20世纪60年代，棒状杆菌(谷氨酸棒状杆菌和短杆菌) 已被广泛地运用于发酵生产谷氨酸盐^[7～10]。然而，从自然界中分离所得的野生菌株，发酵活性一般较低，必须经过人工选育得到突变菌株，才能用于工业化生产。自发突变效率低，诱发突变则可大幅提高诱变的效率。20世纪70年代，随着人们在菌种诱变方面取得突破性的进展以及相关专利的出现^[11, 12]，工业上越来越多采用诱变微生物发酵来制备氨基酸、核苷和核苷酸，相关的专利申请甚至多达4000件。近年来，科学家们对产谷氨酸棒状杆菌的代谢工程^[13]，特别是谷氨酸棒状杆菌突变株的基因序列进行了研究，并将其应用于谷氨酸商品化生产中^[14]。目前，生产谷氨酸钠的公司主要有日本的味之素、中国的阜丰集团、味丹和韩国的CJ CheilJedang公司。在发酵过程中，谷氨酸棒状杆菌除了生成谷氨酸外，还生成另一种氨基酸，即L-赖氨酸。L-赖氨酸的主要用途是饲料添加剂。2013年，L-赖氨酸的产量达到210万吨^[2]。

传统上，基本味觉包括酸、甜、苦、咸、鲜。其中，鲜味是最近才得到认可的基本味觉。日本科学家通过最新的研究成果，提出了厚味的概念。厚味是一种全新的味觉，能增强甜味、咸味和鲜味。低脂肪食品就需要添加这种特殊的香料化合物来增加口感。最新研究显示，L-γ-谷氨酰-L-缬氨酰-甘氨酸即为厚味香料化合物^[15]，能增强低脂肪花生酱的厚味、余味和油腻感，表明该物质能够明显改善低脂类食品的香味^[16]。利用γ-谷氨酰转移酶的突变体可将γ-谷氨酰基转移至缬氨酰-甘氨酸分子，进而制备γ-谷氨酰-缬氨酰-甘氨酸^[17]。

广藿香油 (patchouli oil) 是从中草药广藿香中提取的挥发油，具有木香、壤香和药草香。目前，广藿香油大多由干燥和发酵过的广藿香嫩叶中经蒸馏制备得到^[18]。广藿香醇是广藿香油的主香气成分。广藿香醇是非环化的中间体法尼基二磷酸(farnesyl diphosphate，FPP^[19]) 在广藿香醇合酶的作用下形成的，这种环化酶还能催化生成广藿香中的其他倍半萜类物质。Deguerry等^[20]通过基因重组技术获得广藿香醇合酶，并催化FPP生成了包括广藿香醇在内的14种倍半萜化合物，各种化合物的含量与工业上使用的广藿香油基本一致(见图 1)。瑞士Firmenich公司对此做了大量的研究，2014年，该公司与美国Amyris公司合作开发了CLEARWOOD产品^[21]，可替代香水配方中的广藿香油。

图 1 酶催化和提取得到的广藿香油中各种成分含量比较Fig. 1 The comparison of contents of various constituents in patchouli oil prepared by enzyme catalysis and extraction

香兰素(Vanillin) 最早是从香荚兰豆中分离出来的，有浓烈的奶香香气，是一种广泛使用的香料化合物。1874年，Tiemann首次利用松柏苷的氧化反应实现了香兰素的人工合成^[22]。1876年，Tiemann和Reimer分别报道了从丁香酚^[23]和愈创木酚^[24, 25]出发合成香兰素的方法。随后又出现了以丁香酚、木质素以及愈创木酚/乙醛酸等为原料生产香兰素的工艺^[26]。值得一提的是，由于对环境的担忧，大部分使用造纸厂含有木质素废液来生产香兰素的公司已经被关停。目前，中国主要采用愈创木酚/乙醛酸的方法来生产香兰素^[27]。

香荚兰和香兰素是食品香料工业中最重要的香料产品，全球销售额接近6亿美元，总量接近16000吨^[28]。香兰素主要用途是给冰激凌和巧克力加香，约占75%的份额，剩余的部分用于糖果和烘培食品加香^[29]。在过去的20年里，消费者和市场人员越来越倾向于使用天然香兰素给产品加香。例如，为了迎合消费者对天然香原料的偏爱，雀巢公司2015年宣布年底将不再使用任何的人工色素和香原料给巧克力加香^[30]。然而，这对食品香料工业是一个挑战，这是因为天然香荚兰和香兰素的价格极高。就香荚兰提取物而言，价格受香荚兰豆的成本影响极大。马达加斯加的香荚兰豆出口量约占全球的80%，由于受台风、人工成本、政治动荡和疾病等诸多因素影响，历史上价格大幅波动。2003年，曾达到每千克400美元，2005年却跌至每千克32美元。熟化过的香荚兰豆中含有2%的香兰素，即便香荚兰按每千克25美元来计算，由提取得到的天然香兰素也要卖到每千克1250美元。相对于合成香兰素每千克16美元的价格，这显然高得多。因此，对用生物技术生成香兰素的兴趣是如何将其价格降低至可接受的程度。

1977年，Tasada发现使用土壤微生物棒杆菌菌株(Corynebacterium sp.)^[31]和假单胞菌菌株(Pseudomonas sp.)^[32]，可以将丁香酚转化为阿魏酸和香兰素。1991年，Haarmann & Reimer公司(现为Symrise) 首次采用沙雷氏菌(Serratia sp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)、肠杆菌(Enterobacter sp.) 等微生物菌株将异丁香酚或丁香酚转化为香兰素^[33]。2000年，Rhodia公司采用瑞士Givaudan公司的技术，由阿魏酸合成了商品名称为Rhovanil Natural的天然香兰素^[36, 37]，尽管每千克售价700美元，但相比香荚兰豆价格极高的2003年，已经是很理想的。2014年，法国Mane S.A.公司推出了利用改良过的丁香酚微生物转化生产商标名称为Sense Capture的香兰素^[34, 35]。2015年，Givaudan开发了一种全新的利用生物合成生成阿魏酸的工艺。其中，涉及香豆酸经两步酶过程生成阿魏酸^[36, 37]。随后，上海的爱普香料公司使用一种新的链霉菌(Streptomyces sp.) 对阿魏酸发酵生成香兰素，BASF公司则应用遗传工程得到的假单胞菌(Pseudomonas sp.) 对阿魏酸发酵生成香兰素^[38, 39]。图式1给出了通过丁香酚和阿魏酸合成香兰素的路径。

图式1 丁香酚和阿魏酸合成香兰素的路径Scheme1 The synthesis routes of vanillin from eugenol and ferulic acid

葡萄糖是分布很广且重要的碳水化合物，由淀粉水解得到，原料充足且成本低。1998年，美国密歇根大学的Frost^[40]报道了以葡萄糖为底物，经生物转化生成香兰素的方法，其中使用含有PKL5.26A或PKL5.97A的大肠杆菌KL7作为发酵菌种。基于这项研究成果，瑞士的Evolva公司与International Flavors & Fragrances (IFF) 公司合作，开发了由葡萄糖从头合成香兰素的工艺(图式2)^[41, 42]。2014年，IFF已将其用于产品的加香。值得一提的是，由于香兰素对微生物有毒，发酵微生物生成的产物是香兰素糖苷，随后经水解得到香兰素。

图式2 葡萄糖合成香兰素Scheme2 Synthesis of vanillin from D- glucose

从经济角度来看，利用微生物发酵法生产香兰素较为实用，其具有发酵菌种生长周期短、繁殖量大、发酵条件温和及原料丰富易得等优点，但是也存在菌种发酵合成香兰素的产量低、产物分离困难等问题，这主要是由于香兰素对微生物的毒性较大，一旦形成香兰素，微生物分泌出的酶会很快将其转化为毒性相对较低的香草醇或香草酸，导致香兰素产率很低。人们试图从以下几个方面解决这一问题。例如，通过加入二硫苏糖醇抑制香兰素脱氢酶活性，但是收效并不大，因为累积的香兰素对微生物的毒害加重；使用一些疏水性树脂吸附香兰素从而提高分离纯化产率；选育对香兰素耐受力强且不易将香兰素转化为香草酸的微生物，这一方法在利用阿魏酸转化香兰素上有不错的效果。

龙诞香是抹香鲸体内产生的一种动物性香料，与麝香、灵猫香、海狸香并称为四大动物香料，具有独特的甘甜和土质香味，主要用于香水和烟草中。由于抹香鲸濒临灭绝，以抹香鲸为原料的各种商品都被禁止销售。人们对龙诞香的主成分进行了大量的研究，希望可以找到相应的替代物。

1950年，Stoll小组发现，龙诞香中最重要的致香成分为龙诞香醚，并以香紫苏醇为原料合成了龙诞香醚^[43]。香紫苏醇是从香紫苏植物中提取得到的，将植物的花、叶经水蒸气蒸馏得到香紫苏油，再依次用烷烃和甲醇萃取分离即可得到香紫苏醇。香紫苏醇具有和龙诞香醚类似的碳原子骨架，先经氧化反应生成香紫苏内酯，再经还原、环化反应即可生成龙诞香醚。美国Avoca公司是目前世界上最大的香紫苏醇和香紫苏内酯生产商。最初，他们用高锰酸钾氧化香紫苏醇生成香紫苏内酯^[44]，现在则用生物发酵的方法^[45]。

无论香紫苏醇，还是香紫苏内酯，价格都很昂贵，并且供应量起伏较大。过去十几年，人们对相关的生物合成方法进行了持续的研究。瑞士Firmenich公司^[46]和美国Allylix公司^[47](现已被瑞士Evolvo公司收购) 通过使用香紫苏醇合成中的两个关键酶，焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶(LDPP synthase) 和香紫苏醇合酶(Sclareol synthase)，先催化香叶基香叶基焦磷酸(GGPP) 生成焦磷酸赖百当烯二醇酯(LDPP)，再催化焦磷酸赖百当烯二醇酯(LDPP) 生成香紫苏醇(图式3，途径a)。

最近，日本KAO公司^[48]和德国BASF公司^[49]分别开发了一条龙诞香醚的半生物合成途径(图式3，途径b)。以化学合成的高法尼醇为原料，在环化生成龙诞香醚的过程中，前者使用是角鲨烯-何帕烷环化酶，后者则是使用了具有环化酶活性的多肽。这两种途径都有可能被用于商品化生产过程。

图式3 香叶基香叶基焦磷酸和高法尼醇生物合成龙诞香醚Scheme3 Biosynthesis of Ambrox from GGPP and Homofarnesol

檀香油是世界上最珍贵的精油之一，主要用于高档名贵香水和香料产品中。其中，东印度檀香油以其独特、持久的甜香和木香香气备受欢迎。该精油盛产于印度、印度尼西亚，由檀香科植物白檀(Santalum spicatum) 的木片或根、枝经水蒸气蒸馏得到。20世纪70年代，印度是世界上最大的东印度檀香油供应国，产量达到了100吨，约占世界总产量的90%^[50]。然而由于木材生长周期长、过度开采导致的资源匮乏、加工成本高等内在因素，再加上非法走私和印度政府的严加管控，市场上东印度檀香油已经供不应求，并且价格更是高到每千克2500美元^[51]。例如，2005年，印度还是国际市场上该精油的净出口国，但在2013～2014年间，其出口仅420千克，进口却达到了惊人的34.4吨^[52]，类似的情况也发生在印度尼西亚。目前，世界上东印度檀香油每年的需求量大约是80～120吨，这其中还包括了15～20吨的澳大利亚檀香油以及1～2吨的新喀里多尼亚檀香油替代物。由于供不应求，人们只能使用大量的人工合成檀香香料来填补这一空缺。

东印度檀香油作为一种珍贵的香料，很早就成为一个科学研究的热点。该挥发油的主香气成分是倍半萜醇类化合物，其中，(Z)- α-檀香醇、(Z)- β-檀香醇、(Z)-epi-β-檀香醇和(Z)- α-exo-佛手醇的总量达到了90%。研究显示，(-)-(Z)- β-檀香醇(18%～24%) 是东印度檀香油中最重要的香气成分，具有典型的檀香木香气，并伴随着浓烈的木香和奶香。尽管文献中有很多合成(-)-(Z)-β-檀香醇的方法，但至今还未找到一条适合工业化生产的路线。最近，Firmenich公司^[53～58]和Allylix公司^[59～62]通过生物合成的手段来研制β-檀香醇及天然檀香油。他们通过使用檀香烯合酶可以合成α-檀香烯、β-檀香烯和α-exo-佛手烯，这些化合物在理论上只需发生羟基化反应就可以生成相应的α-檀香醇或天然檀香油。Bohlmann小组^[60]也报道了天然檀香油的生物合成方法，他们使用重组的檀香烯合酶来合成檀香烯和佛手烯，随后在一种细胞色素P450酶的作用下进一步发生氧化，可以得到檀香醇和佛手醇。遗憾的是，通过该方法制备的檀香醇，主要为反式构型产物，产率也偏低(见图 2)。

图 2 对酶催化法和提取法所得檀香油的GCMS分析Fig. 2 GCMS analysis of sandalwood oil prepared by enzyme catalysis and extraction

尽管目前食品香料工业大量使用的香料化合物仍来自化学合成，但是市场的兴趣正在向天然香料化合物转移，这给香精香料生产商带来了新的机遇和挑战，生物技术特别是生物发酵工艺和酶催化工艺将吸引越来越多的关注。一方面，人们普遍认为通过生物技术生产合成的香料化合物是天然的。另一方面，与传统从动植物中提取的工艺相比，生物技术工艺在生产和供应过程中有更大的控制权。近年来，特别是2014年，工业上利用生物技术生产香原料取得了显著的进展，并开发了许多重要的香料化合物。现在，包括Amyris、Evolva和Allylix公司在内的香精香料新秀已经在利用生物工艺生产香料化合物。Firmenich和Symrise在内的老牌香精香料公司也正在关注生物工艺，并实现产业化生产。有理由相信，香精香料行业正在经历一次新的技术革命。