香兰素生物合成的研究进展

香兰素(vanillin)又称香草醛、香兰醛，化学名为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，是世界上使用最广泛的调味料之一，在食品、药品、化妆品、农业等领域被广泛应用[1]。香兰素具有“食品香料之王”的美称[2]，可在食品中起到助香、增味的作用，也可作为食品防腐添加剂使用；在医药方面，香兰素具有保健、医疗的作用，同时也是合成多种药物的重要原料；香兰素在化妆品、香水等领域可作为调香剂，在农业生产中也可作为农作物的催熟剂和增产剂，还可以用作导电剂、氧化助剂、消泡剂等[3-4]。目前我国的香兰素年消费量在2 000-2 500 t[2]。

从香子兰花荚中提取的香兰素为天然制品，但原料香子兰荚果的供应有限，该提取方法劳动强度大、加工周期长、制品的价格也十分昂贵[2]，使得天然提取法获得的香兰素远远不能满足市场需求。

化学合成法产香兰素(丁香酚法、木质素法、4-甲基愈创木酚法、愈创木酚二甲基苯胺法、愈创木酚-乙醛酸法等)在当今市场上占主导地位，其中木质素法和愈创木酚-乙醛酸法最为常用[5]。通过化学合成法生产的香兰素价格低廉，每千克的市场价格约为15美元，但该法制得的香兰素在很多方面都不如天然提取的香兰素[6]。例如，反应过程中会导致不必要的外消旋混合物的形成，同时也缺乏底物选择性[3-4]。由于不环保的工艺过程，该法生产的香兰素在全球范围内受到食品和制药行业的限制[7]。

由于天然提取法与化学合成法存在种种不足，致使人们越来越重视微生物转化法生产香兰素，其中，丁香酚、异丁香酚和阿魏酸是该法生产香兰素的主要底物[1]。天然底物经生物转化产生的香兰素被称为“天然香兰素”，其在价格以及品质方面都比化学合成的香兰素占有优势；此外，微生物具有生长迅速且易于进行基因工程改造优化等优点，为生产香兰素的生物技术法提供了合适的平台；利用微生物生产香兰素并借助代谢工程改造等技术进一步提高香兰素的产量将是一种非常具有发展前景的研究方向[6]。

丁香酚(eugenol)，又名4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，是印尼丁香油的主要成分，具有原料易得、工业合成简单且效率高等优点。丁香酚作为一种廉价的原料被广泛用于药品、食品、香料、抗氧化剂等，有望成为生态友好型化学合成物质的主要成分[8]。

早在1977年，Tadasa[9]首次报道了棒状杆菌能够将丁香酚转化为香兰素，该菌能以丁香酚为唯一的碳源和能源得到阿魏酸与香兰素，并进一步代谢形成香草酸和原儿茶酸，原儿茶酸再通过邻位裂解进一步分解代谢。Rabenhorst[10]分离出一株新的假单胞菌HR199菌株，该菌株可以利用丁香酚产生松柏醇、松柏醛、阿魏酸和香草酸，但未被检测到作为中间体的香兰素。

丁香酚的分解代谢途径在真菌中研究得较少，在细菌假单胞菌中已被较为详细地描述，分解代谢途径中的酶及其相应的结构基因也已得到鉴定[6]。假单胞菌中丁香酚的分解代谢依次通过松柏醇、松柏醛、阿魏酸、香兰素、香草酸、原儿茶酸进行，原儿茶酸通过邻位裂解再进一步分解，其具体代谢路径及相关的编码基因如图 1所示。

图 1　假单胞菌中丁香酚的降解途径[6]Figure 1　Eugenol degradation pathway in Pseudomonas[6]

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目前已发现恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、肠杆菌(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌(Serratia)、黑曲霉(Aspergillus niger)、棒状杆菌属(Corrynebacterium sp.)、球形菌(Arthrobacter globiformis)等可将丁香酚或异丁香酚转化为香兰素[11-13]。

Ashengroph等[14]分离出一株食树脂假单胞菌(Pseudomonas resinovorans SPR1)，该菌株能够将丁香酚转化为香兰素及相关酚醛芳香产物。在进一步优化条件之前，经过30 h和60 h的生物转化后分别产生0.24 g/L香兰素(转化率为10%)和1.1 g/L香草酸(转化率为44%)。近年，Singh等发现了一株新的芽孢杆菌沙福芽孢杆菌，在优化各种培养条件下使用该菌株的静息细胞，经96 h的生物转化后得到单一的代谢物香兰素0.12 g/L[15]，转化途径如图 2所示。静息细胞具有反应时间较短，可自由改变反应液中底物与菌体的比例，生物量积累快，产物易分离提取等优点[16-17]，在生物转化产香兰素的应用中可使香兰素的浓度有所提高。

图 2　沙福芽孢杆菌SMS 1003中丁香酚的代谢途径Figure 2　metabolic pathway of eugenol in Bacillus safensis SMS 1003

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从丁香酚到香兰素的生物转化途径中，产率大多比较低，只能得到微量的香兰素。为了提高香兰素的产率，研究人员对菌株进行了代谢工程的改造研究与运用。Overhage等[18]通过在香兰素脱氢酶基因(vdh)中插入ω因子使其失活从而构建假单胞菌HR199突变菌株，在含6.5 mmol/L丁香酚的培养基中可以积累2.9 mmol/L的香兰素，但由于另一种与松柏醛脱氢酶具有相似活性的香兰素脱氢酶VDH-Ⅱ的存在，累积的香草醛被进一步降解。因此，仅使vdh失活并不是解决方案，需要进一步的基因操作。研究人员Banerjee等提出通过灭活、敲除或阻断钼酸盐转运体(提供VDHs的辅助因子)的操作将有助于在生物转化过程中增加香兰素的产量[3]。

此外，研究人员还建立了从丁香酚到香兰素的两步生物转化过程[19]，如图 3所示。第一步，先用重组大肠杆菌XL1-Blue (pSKvaomPcalAmcalB)将丁香酚转化为阿魏酸，阿魏酸最大浓度可达14.7 g/L；第二步，再用大肠杆菌(pSKechE/Hfcs)将阿魏酸转化为香兰素，香兰素产率为0.3 g/L[19-20]。

图 3　两步生物转化合成香兰素代谢途径Figure 3　A two-step biotransformation for vanillin synthesis

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Plaggenborg等[21]在红球菌(Rhodococcus opacus) PD630基因工程菌中建立了丁香酚的生物转化代谢途径：将简青霉(Penicillium simplicissimum) CBS 170.90的香草醇氧化酶基因(vaoA)与假单胞菌HR199中的松柏醇脱氢酶基因(calA)和松柏醛脱氢酶基因(calB)在红球菌PD630中表达，重组菌株将丁香酚转化为阿魏酸，阿魏酸可转化为香兰素。Overhage等将简青霉(Penicillium simplicissimum) CBS 170.90的香草醇氧化酶基因(vaoA)克隆到革兰氏阳性菌的载体中，并在拟无枝酸菌(Amycolatopsis) HR167中表达。Amycolatopsis HR167 (pRLE6SKvaom)在实验中表现出非常高的香兰素耐受性，研究人员提出通过额外表达calA和calB可建立丁香酚定量转化为香兰素的工程菌株[22]。

异丁香酚(isoeugenol)，又名4-丙烯基-2-甲氧基苯酚，与丁香酚互为同分异构体，两者均可以经化学法或微生物法生成香兰素。异丁香酚也存在天然来源，但工业上主要是通过丁香酚在KOH或NaOH作用下进行异构化而得[23]。微生物转化和酶促转化已被广泛应用于研究异丁香酚到香兰素和相关代谢物的生物转化。研究发现有些菌株因底物不同时香兰素产量存在较大差异，在粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中异丁香酚生物转化产香兰素的收率高于丁香酚产香兰素[12]。在微生物发酵法生产香兰素中异丁香酚比丁香酚更具有优势[24]。

研究表明，在细菌和真菌中异丁香酚通过环氧化物-二醇途径生物转化为香兰素。Hua等[25]提出的异丁香酚在芽孢杆菌菌株S-1中的具体代谢过程如图 4所示。该菌株能将异丁香酚高效生物转化为香兰素，150 h内由10 g/L的异丁香酚可转化得到3.75 g/L的香兰素，摩尔产率为40.5%。

图 4　芽孢杆菌菌株S-1中异丁香酚的代谢途径[25]Figure 4　metabolic pathway of isoeugenol in Bacillus strain S-1[25]

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Abraham等在黑曲霉(Aspergillus niger) ATCC 9142中首次完成了以异丁香酚为底物产香兰素的生物转化，但因香兰素会进一步降解为香草酸和香草醇，转化率仅为10%[26]。Shimoni等[27]发现枯草芽孢杆菌B2能以异丁香酚为唯一碳源生长，该菌株可产生0.61 g/L的香兰素(摩尔产率为12.4%)；此外，离子交换树脂XAD-2的使用可有效改善菌株B2在异丁香酚中的生长特性。Furukawa等[28]研究发现恶臭假单胞菌I58可利用异丁香酚直接降解为香兰素，转化率为14%。Zhao等[13]首次从土壤中分离到的一株新型梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis) CGMCC1347能以60% (体积比)异丁香酚为底物和溶剂，在两相体系以及适宜的培养条件下获得32.5 g/L的香兰素。由于异丁香酚难溶于水，DMSO的加入可增强其溶解度，使得香兰素的产率有所提高，香草酸的形成也因此受到抑制[29]。Yamada等[29]类比Zhao等[13]的方法提出，添加10% (体积比) DMSO的单相体系比两相体系更有利于香兰素的高效生产。

Zhao等[30]用海藻酸钠成功地固定化了梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis) CGMCC1347细胞，固定化细胞经重复使用6次后，香兰素平均浓度可达到39.26 g/L。以异丁香酚为底物产香兰素的生物转化过程中静息细胞的使用也可使香兰素的产量有所提高[31]，在念珠菌(Candida galli) PGO6[32]、阿氏丝孢酵母(Trichosporon asahii) MP24[33]中均利用了静息细胞。

在香兰素生物合成的研究过程中已发现了一些新酶，这些发现为提高香兰素的产量提供了新的科学机会。酶法具有高效性、专一性、环境友好、立体选择性强、反应条件温和等优点，采用酶法制备香兰素生成的副产物也较少，但酶法也具有不稳定、成本高、不易分离等缺点[34]。随着研究的深入，可以通过适宜的方法降低生产成本，分离出所需的酶并利用酶促反应高效地合成香兰素。

据报道，异丁香酚可在粘质沙雷氏菌菌株(Serratia marcescens) DSM 30126中经一步发酵获得香兰素[12]。孙敏等[35]直接采用粘质沙雷氏菌AB 90027离体酶催化氧化异丁香酚获得了10.90%的香兰素产率，并认为在酶的作用下异丁香酚可以通过阿魏酸和香兰素两条途径被开环降解，能够降解香兰素的酶主要为胞外酶。

Yamada等[36]从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) IE27中纯化出一种异丁香酚降解酶，并对该酶基因进行了克隆与分析，研究发现异丁香酚降解酶是一种单加氧酶，首次报道了异丁香酚单加氧酶催化双键裂解形成香兰素。研究人员将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) IE27的异丁香酚单加氧酶基因插入载体pET21a中，并将重组质粒导入不具备香兰素降解活性的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，该细胞在20 ℃培养6 h条件下可由230 mmol/L的异丁香酚产生得到28.3 g/L的香兰素且不形成香草酸，摩尔转化率为81%[37]。

Ryu等[38]研究发现，硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens) Jin1的异丁香酚单加氧酶的氨基酸序列与来自恶臭假单胞菌IE27的异丁香酚单加氧酶具有81.4%的相似性，含有异丁香酚单加氧酶的基因区域在单步反应中可将异丁香酚转化为香兰素；其中iem与iemR参与异丁香酚向香兰素的转化过程，推测Iem可能是一种单组分酶，这为微生物生产天然香兰素提供了一种简单的生物催化路线。

2012年，赵丽青等[39]对从土壤中筛选获得的纺锤芽孢杆菌CGMCC1347生产异丁香酚单加氧酶的发酵条件进行了研究，在最适培养条件下，经过16 h的培养后，该菌株能将2%的异丁香酚转化生成2.49 g/L的香兰素，异丁香酚单加氧酶酶活可达到3.79 U/L。为了有效地提高异丁香酚单加氧酶的活性，Zhao等[40]将两亲性短肽18A与异丁香酚单加氧酶融合，成功构建了活性聚集体IEM720-18A，然后在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，通过优化培养条件，香兰素的浓度可以达到14.5 mmol/L，该研究为异丁香酚生物转化产香兰素提供了一种新的方法。

阿魏酸(ferulic acid)，化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，广泛存在于药用、食用植物中[41]。阿魏酸具有对底物毒性较小、产率高、来源丰富等优点，但以该物质为底物生产香兰素的不足之处在于原料价格相对于丁香酚高。

目前已发现能以阿魏酸为底物产香兰素的菌株有：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、拟无枝酸菌(Amycolatopsis)、食酸丛毛单胞菌(Delftia acidovorans)、肠杆菌(Enterobacter)、红球菌(Rhodococcus opacus)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、链霉菌(Streptomyces)、朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)等，其中可通过阿魏酸生物转化一些拟无枝酸菌(Amycolatopsis)和链霉菌(Streptomyces)中的某些菌株得到较高产量的香兰素(超过10 g/L)，基本可以用于工业化生产[42]。但因利用放线菌为宿主发酵得到的产物不易分离及纯化等原因使得下游的加工成本过高[43]。因此，需继续发掘高产、耐受底物能力强、易分离纯化的菌株，并深入掌握对基因工程改造目标菌株的应用。

研究表明，许多假单胞菌中含有香兰素合成以及进一步降解的基因，且代谢途径大致相同[43]。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) BF13中阿魏酸降解途径的关键酶及其相应的基因如图 5所示。

图 5　荧光假单胞菌BF13中阿魏酸降解的示意路径[44-45]Figure 5　Schematic pathway for the degradation of ferulic acid in P. fluorescens BF13[44-45]

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赵希景[46]从漳州古雷半岛潮间带沉积物中筛选到的海洋放线菌B-32可在1 g/L阿魏酸的发酵液中获得0.71 g/L的香兰素，该研究为海洋放线菌在工业化生产中的运用提供了理论依据。Chen等[47]筛选到枯草芽孢杆菌B7-S能利用阿魏酸产香兰素，转化率可达到63.30%；此外，该菌株的细胞表面在诱导阿魏酸耐受性中起着重要的作用。王兴林等[48]从土壤中筛选出一株广温拟无枝酸菌(Amycolatopsis eurytherma)的变种CCTCC M 2011265，该菌株对底物阿魏酸具有较高的耐受性，经过发酵罐放大实验香兰素最大浓度可达8.63 g/L (摩尔转化率为56.2%)。

在转化过程中分批补料发酵方式以及树脂的加入有利于香兰素产量的增加[49]。除分批补料法外，Vyrides等[50]采用盐单孢菌株(Halomonas) B15的静息细胞法作为提高阿魏酸生物转化为香兰素的策略，48 h后可由0.5 g/L的阿魏酸获得0.245 g/L香兰素，转化率为49%。

1996年，Lesage-Meessen等以阿魏酸为底物对“两步生物转化法”产香兰素进行了研究：阿魏酸首先由黑曲霉(Aspergillus niger)转化为香草酸，再利用朱红密孔菌(P. cinnabarinus)将香草酸还原为香兰素；但由于香草酸氧化体系中产生的甲氧基对苯二酚在P. cinnabarinus的培养基中占主导地位，使得香草酸还原成香兰素的量较少，导致香兰素的含量相对较低[51]。为了提高香兰素的产量，研究者对丝状真菌P. cinnabarinus将香草酸转化为香兰素进行了进一步的研究。研究表明，在P. cinnabarinus的培养物中加入纤维二糖可降低甲氧基对苯二酚的水平，使香兰素的产量有所增加，达到0.725 g/L[52]。

郑丽蓉等[53]也对“两步生物转化法”进行了研究，利用黑曲霉CGMCC0774和朱红密孔菌CGMCC1115联合转化阿魏酸产香兰素，通过对黑曲霉60Co诱变得到了一株对底物耐受性强且不降解产物的突变株，香兰素的浓度可达到1.07 g/L。

随着对阿魏酸生物转化产香兰素相关酶的研究不断增多，对应编码基因的鉴定和表征不断清晰，基因工程菌的构建技术不断成熟。因研究人员对大肠杆菌的生理生化特征以及遗传背景了解逐渐深入且大肠杆菌本身不含有香兰素合成及降解的基因，所以基因工程在大肠杆菌中广泛应用[43]。大肠杆菌的一个主要缺点是重组菌株的遗传不稳定性会导致香兰素的产量迅速下降[54]。Barghini等[55]利用具有低拷贝数载体的大肠杆菌菌株JM109的静息细胞和表现出低活性驱动分解代谢基因表达的启动子，获得了较高的香兰素产量。

di Gioia等[45]使荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens BF13)中编码香兰素脱氢酶的vdh基因失活，同时转入一个阿魏酰辅酶A合成酶(fcs)和水合酶/醛缩酶(ech)的低拷贝重组质粒，在优化培养条件和生物转化参数后可使香兰素产率提高至8.41 mmol/L (相当于约1.28 g/L)。

Graf等[56]对非致病性恶臭假单胞菌菌株KT2440进行了遗传优化，tac启动子系统的引入增强了阿魏酰辅酶A合成酶(fcs)和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶(ech)结构基因的染色体表达，进一步的遗传工程提高了香兰素的初始转化率，仅3 h摩尔产量可高达86%。

Fleige等[57]通过同源重组完成了拟无枝酸菌属ATCC39116的香兰素脱氢酶基因(vdh)的精确缺失，使香兰素的降解降低90%以上，该突变使香兰素的最终浓度超过2.2 g/L，摩尔产量为80.9%；香兰素的合成代谢基因ech和fcs的组成型和增强型表达使得香兰素的浓度进一步提高，最终得到香兰素浓度为19.3 g/L，摩尔收率为94.9%；此外，使用改进的进料策略可使香兰素的浓度达到22.3 g/L，这是截至目前报道的由Amycolatopsis sp. ATCC39116产生的最高的香兰素浓度。

2019年，Luziatelli等[58]开发了一种新的大肠杆菌菌株FR13，将携带编码阿魏酰辅酶A合成酶、阿魏酰辅酶A水合酶/醛缩酶的假单胞菌基因整合到大肠杆菌染色体中，在优化生物过程变量并使用两相(固液)系统控制阿魏酸的释放后，使香兰素的产量达到28.10±0.05 mmol/L，由此他们提出，重组无质粒的大肠杆菌菌株在工业规模化生产香兰素中具有较大潜力。

本课题组主要从事微生物合成方面的研究[59-62]，目前已筛选获得可利用阿魏酸和丁香酚产香兰素的菌株，后期将通过合成生物学的方法对其香兰素代谢合成途径进行改造，以期进一步提高香兰素产量。

我们实验室在丁香酚产香兰素生物转化过程的研究中发现存在以下问题：(1)丁香酚对微生物的生长存在一定的抑制作用，从土壤中筛选到的菌种能耐受丁香酚的浓度并不高；(2)产物香兰素会进一步代谢产生其他物质；(3)香兰素对微生物的生长也存在一定的抑制作用。

基于以上问题，我们认为可以从以下几个方面进行深入研究：(1)对高产菌株中的关键酶性质、作用机制以及是否存在特殊的调控基因或途径进行深入的研究，借助基因工程技术对酶进行定向改造得到性能显著的菌株；(2)通过抑制参与香兰素降解的酶活性来阻止其进一步转化，但该方法在假单胞菌中具有一定的局限性，因为在该菌株中存在类似的脱氢酶也能使香兰素进一步降解，因此可以在日益增长的基因数据库中寻找更适合生产的替代基因；(3)利用微生物的全细胞、静息细胞、固定化细胞及其细胞酶制剂等提高产物的产量并减少副产物的产生。