孙薇1,2，丁冬芹2，柏丹阳2，朱亚如2，解晓彤2,3，张大伟2
（1天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308；3大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116000）
引用本文: 孙薇, 丁冬芹, 柏丹阳, 朱亚如, 解晓彤, 张大伟. 芳香族氨基酸及其衍生物的细胞工厂构建策略[J]. 合成生物学, 2021, 2(6): 982-999
Citation: SUN Wei, DING Dongqin, BAI Danyang, ZHU Yaru, XIE Xiaotong, ZHANG Dawei. Strategies of cell factory construction for the production of aromatic amino acids and their derivatives[J]. Synthetic Biology Journal, 2021, 2(6): 982-999
DOI: 10.12211/2096-8280.2021-002
摘 要
芳香族氨基酸及其衍生物由于其特定的生理活性，已广泛应用于医药、食品、饲料和化工等行业。利用重组微生物发酵生产芳香族氨基酸及其衍生物是满足全球日益增长需求的有效途径。通过将代谢工程策略与合成生物学、系统生物学和生物工程的发展相结合，在菌株的改造及优化方面取得了显著的进展。然而，合成芳香族氨基酸及其衍生物的代谢途径长且调控机制复杂，通过简单的代谢途径改造难以大幅提高产量，因此，近年来出现了很多相关的改造方法，为克服代谢途径中的限速问题提供了很好的借鉴意义。本文回顾和比较了最近在芳香族氨基酸及其衍生物合成方面应用的成熟技术和策略，包括常用的代谢途径改造策略（如增加前体供给、解除关键酶和阻遏蛋白的反馈抑制和阻遏抑制、改造转运系统、全局调节系统）以及菌株生长与生产产品耦联和菌株构建方法（如基于生物传感器的高通量筛选以及对培养基和培养条件的优化等），未来相关前沿技术如计算机辅助途径酶改造技术和筛选高产菌株的定向进化技术将助力芳香族氨基酸及其衍生物高产菌株的构建。
全 文
芳香族氨基酸是指分子结构式中含有苯环的氨基酸，包括色氨酸（L-Trp）、酪氨酸（L-Tyr）和苯丙氨酸（L-Phe），存在于绝大多数生命体中，也可从食物中获得。此外，芳香族氨基酸的生物学功能对于改善人们生活具有重要的推动作用，目前已被广泛应用于食品、医药、饲料和化工等多个行业。其中，L-Trp具有提高睡眠质量、抗兴奋以及预防胃溃疡和提高免疫力的生理功能；L-Tyr常被用作营养补充剂来治疗脊髓炎、结核脑炎和甲状腺机能亢进等疾病；L-Phe可用于生产新型甜味剂阿斯巴甜，也是复配氨基酸输液的重要成分之一，还可作为抗癌药物的中间体和良好载体。
芳香族氨基酸衍生物是由芳香族氨基酸衍生出的一类具有高附加值的化合物，这些衍生物大多通过化学化工合成或从天然产物直接提取。随着合成生物学的发展，人们利用生物合成技术可将芳香族氨基酸直接转变为其衍生物，既保护环境，又避免了天然产物提取困难的问题。芳香族氨基酸是其衍生物的重要前体，由此可见，探究芳香族氨基酸生物合成的同时也促进了其衍生物合成的发展，两者在现代市场中都具有较大的商业价值，所以研究其生物合成必不可少。
1 芳香族氨基酸的合成途径及生产方法
1.1 合成途径
研究表明，芳香族氨基酸合成途径主要分为三大模块：中心碳代谢途径（CCM）、莽草酸（SHIK）途径和分支酸（CHA）途径，如图1所示。芳香族氨基酸合成途径，以葡萄糖（Glc）为起点，经过CCM途径，相继生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P），紧接着二者缩合生成3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP），DAHP经过SHIK途径依次生成SHIK和CHA，最终由CHA分别生成L-Trp、L-Tyr和L-Phe。
图1 芳香族氨基酸的合成途径
PTS—磷酸转移酶系统；G6P—葡萄糖-6-磷酸；3PG—3-磷酸甘油酸；PYR—丙酮酸；ACoA—乙酰辅酶A；Cit—柠檬酸；Oxa—草酰琥珀酸；AKG—α-酮戊二酸；OAA—草酰乙酸；6PGNL—6-磷酸葡萄糖内脂；ANT—邻氨基苯甲酸；Indole—吲哚；PRE—预苯酸；PPN—苯丙酮酸；HPP—4-羟基苯丙酮酸；ptsGHIccr—编码磷酸转移酶基因；ppc—编码PEP羧化酶基因；pckA—编码PEP羧激酶基因；tktA—编码转酮酶基因；aroG/F/H—编码DAHP合酶基因；trpE/D—编码ANT合酶基因，tyrA/pheA—编码CHA变位酶基因
表1 芳香族氨基酸生产方法的比较
1.2 合成方法
芳香族氨基酸的生产方法有天然蛋白质水解法、化学合成法、转化法（酶转化法和微生物转化法）和微生物发酵法等。每种方法都有各自的优缺点，见表1。目前微生物发酵法是最常用的芳香族氨基酸生产方法，由于芳香族氨基酸合成途径相对较长且复杂，获得工业化高产菌株是微生物发酵法生产芳香族氨基酸的一大瓶颈。随着现代生物技术的发展，利用代谢工程与合成生物学等相关知识对生产菌株进行改造，是提高芳香族氨基酸产量的一种重要方式。
2 芳香族氨基酸生物合成的影响因素及改造策略
2.1 芳香族氨基酸生物合成的影响因素
由于合成芳香族氨基酸的代谢途径较长，中间产物繁多且复杂，所以影响芳香族氨基酸合成的因素也多种多样，主要包括基于代谢途径的影响因素，例如前体的供给水平、关键酶受到的反馈抑制、调控蛋白对合成途径的转录调节、转运蛋白的转运效率以及基于菌株个体的改造方法等。基于代谢途径的常见影响因素见表2。
表2 芳香族氨基酸合成的影响因素
2.2 芳香族氨基酸生物合成的改造策略
2.2.1 改造中心碳代谢途径，增加前体供给水平
（1）增加PEP供给水平
PEP是芳香族氨基酸合成途径中的重要前体之一，研究表明，流向PEP的碳通量要比流向E4P的碳通量高一个数量级。PEP在糖酵解（EMP）途径中是一个多种酶共同竞争的底物，其生成量和消耗量会对SHIK途径的碳通量造成显著影响。当大肠杆菌以葡萄糖为唯一碳源生长时，负责葡萄糖摄取和磷酸化的PTS系统消耗50%的PEP，进而导致进入莽草酸的碳通量降低了一半。在此前提下，以葡萄糖为碳源生成DAHP的最大理论产量为0.43 mol/mol葡萄糖。如果单纯去除PTS系统，细胞内的PEP的积累量会有相对的提高，但葡萄糖的转运速率却随之降低，甚至还会影响细胞的生长状态。所以，研究者多采用非PTS系统来降低PEP的消耗。Patnaik等以木糖为碳源，发现DAHP的最大理论产量可达到0.71 mol/mol木糖。Carmona等与Chen等的研究证明了使PTS的胞质成分失活（例如ptsHIcrr操纵子）已成为取消PTS促进的葡萄糖转运系统的代表策略。但是，PTS缺陷型菌株的生长能力通常严重受损。为了恢复PTS缺陷菌株中的葡萄糖转运，激活其他潜在的糖转运蛋白或载体，例如半乳糖通透酶（GalP）和葡萄糖激酶（Glk）途径，可以作为一种有前途的策略。Chen等提到GalP/Glk依赖菌株的最大理论产量经计算为0.45 g/g，约为PTS依赖菌株的2倍，这为增加PEP供给水平提供了一个很好的研究方向。吴涛等利用Red同源重组系统构建了一株PTS突变菌株（敲除基因ptsHI、crr和glf，过表达glk），在50 L发酵罐中进行分批发酵，对照原菌株L-Trp产量提高了25.9%。
除此之外，与PEP合成和消耗相关的基因主要有ppsA（编码PEP合酶）、pckA、ppc、pykA和pykF（编码丙酮酸激酶）（图2）。研究者多采用敲除或者过表达的基因改造方法来提高PEP的积累量。例如，Berry和Gosset等通过实验发现，单独敲除编码丙酮酸激酶的基因pykA或pykF，对DAHP的产量不会造成任何的影响，但如果同时敲除两个基因（pykA和pykF），DAHP的产量会增加到原来的3倍。近年来有学者结合前人的改造方法，同时替换相应基因的启动子，如Du等选择TRP1为出发菌株，先是敲除基因tnaA和mtr，阻止L-Trp的降解和运输，其次分别把Ptrc-trpE、Ptrc-aroG整合至trplE和tyrR的基因座中，提高了色氨酸操纵子活性并减轻了TyrR蛋白对ANT合酶的反馈抑制，接着过表达基因pps、pck和citT，增加了PEP供应和增强了柠檬酸的运输，最后使用基因大片段整合方法使PacnB启动串联基因acnBA和icd的转录，以增强TCA循环，并在5 L生物反应器中发酵36 h，L-Trp的浓度达到49 g/L。
图2 PEP和E4P合成途径的改造
（“绿色箭头”表示过表达，“红色叉号”表示敲除）
F6P—果糖-6-磷酸；FBP—果糖1，6-二磷酸；G3P—甘油醛-3-磷酸；1，3-2PG—1，3-二磷酸甘油酸；3PG—3-磷酸甘油酸；2PG—2-磷酸甘油酸；Isocit—异柠檬酸；AKG—α-酮戊二酸；6PG—6-磷酸葡萄糖酸；RU5P—核酮糖-5-磷酸；X5P—木酮糖-5-磷酸；R5P—核酮糖-5-磷酸；S7P—景天庚酮糖-7-磷酸；G3P—甘油醛-3-磷酸；acnBA—编码乌头酸酶基因；icd—编码异柠檬酸脱氢酶基因；zwf—编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因
（2）增加E4P的供给水平
E4P是芳香族氨基酸合成途径中另一个重要前体，其是在磷酸戊糖途径（PPP）中由转酮酶和转醛酶催化生成。转醛酶是由基因talB编码，转酮酶是由基因tktA和tktB编码，其中只有tktA对E4P的生成起主要的调节作用。此外，通过弱化EMP途径，可以增强PPP途径的碳通量，这也是一种提高E4P积累量的有效策略。
Tyagi等通过在缺失aroB基因的大肠杆菌菌株中过表达tktA基因，发现DAHP的积累量有一定的提高，之后又同时过表达aroGfbr和tktA基因，发现从葡萄糖到芳香族氨基酸的碳通量额外增加两倍；除此之外，Mascarenhas等通过敲除编码磷酸葡糖异构酶基因pgi，发现EMP途径被阻断，进而造成碳通量转移到PPP途径中，最终导致L-Trp在发酵罐中的产量提高了2倍，但是此种方法降低了菌株的生长率。Liu等与Guo等通过在酵母中引入异源磷酸酮醇酶实现了前体E4P通量的提高，进而增强芳香族氨基酸的生产，大肠杆菌中也可尝试此方法进行。
2.2.2 解除关键酶的反馈抑制作用和消除TrpR、TyrR蛋白的阻遏作用
为了提高芳香族氨基酸的产量，解除终端产物对关键酶的反馈抑制作用也是十分有效的方法。在芳香族氨基酸合成途径中，最关键的酶是DAHP合酶、ANT合酶以及CM-PDT。大多研究者都是通过诱变育种随机筛选突变菌株或分析关键酶的蛋白三维结构对其进行定点突变，从而达到解除终端产物对其反馈抑制的目的。如表3所示，Dodge等将含有色氨酸操纵子的组成型质粒（trpEfbr、trpDfbr）转化到缺失trpR和tnaA基因的宿主菌中，经过27 h的发酵罐发酵，L-Trp的产量达到6.2 g/L，之后，在该菌株的基础上，对其进行多次诱变育种，L-Trp的产量达到30 g/L，为了继续提高L-Trp的产量，又在发酵中期添加了一定量的表面活性剂L61，最终L-Trp的产量达到54.5 g/L，这是现在为止报道的大肠杆菌产L-Trp的最高产量。刘双平等先通过灭活ccr基因减少了PEP的损耗，其次通过设置基因开关控制phefbr、aroG15、ydiB、aroK和tyrB的表达，以增加前体的供应，接着使用含有tyrA突变体的大肠杆菌菌株来减少碳的转移，最后通过过表达yddG基因促进L-Phe的外排，在发酵罐中进行发酵，L-Phe的积累量可达到47 g/L，此产量是在没有优化发酵条件的情况下的最高产量。Fernstrom等利用DNA重组技术，构建了一株含有基因trpEfbr、aroFBL和serAfbr的大肠杆菌生产菌株，同时敲除基因sdaB、tnaA、trpL和tnaA，并将多拷贝质粒pF112-aroFBL-kan转化至菌体中，在15 L全自动搅拌釜式生物反应器中发酵，L-Trp浓度可达12.5 g/L。Zeng等通过纯理性改造，将解除反馈抑制的serA基因插到DAHP合酶的基因座中，通过分批补料方式在发酵罐中进行发酵，L-Trp的产量可达34～40 g/L，而对于纯理性改造L-Trp，其产量和生产力几乎是以往研究的两倍。
表3 芳香族氨基酸合成途径中抗反馈抑制的关键酶
消除阻遏蛋白的阻遏作用也是提高芳香族氨基酸产量的常用方法（图3），古鹏飞通过敲除trpR、tnaA，既解除了TrpR蛋白的阻遏作用，又降低了L-Trp胞内的降解，最终提高了L-Trp的产量。在此基础上他使用5CPtacs启动子取代了色氨酸操纵子野生型启动子，进一步增强启动子强度，接着采取一步法敲除了色氨酸衰减子，消除了其衰减作用，最后通过摇瓶发酵，L-Trp的产量可达10.15 g/L。Muñoz等在PTS-大肠杆菌生产菌株中敲除了tyrR基因，不仅提高了前体PEP的积累量，还解除了TyrR蛋白的反馈阻遏，经过进一步发酵，L-Tyr的产量相比原菌株提高了1.9倍。Kim等在大肠杆菌菌株中通过敲除编码TyrP通透酶的tyrP基因，并过表达aroGfbr、aroL和tyrC基因，在发酵罐中进行发酵，L-Tyr的产量可达43.1 g/L。刘丽娜等通过敲除fruR基因，使阻遏蛋白FruR失活，提高了大肠杆菌FB-04中L-Trp的产量。通过敲除关键酶以及限速酶，既解除了其对芳香族氨基酸合成途径的反馈抑制，也增强了合成途径的碳通量，是提高芳香族氨基酸产量的常用改造策略，同时，敲除TrpR和TyrR这两个阻遏蛋白，消除了其对芳香族氨基酸合成途径的阻遏作用，根据以上改造策略，生物合成芳香族氨基酸的研究取得了一定的进展，见表4。
表4 芳香族氨基酸及其衍生物生产概况
图3 关键酶的反馈抑制和调控蛋白的阻遏作用
（“虚线”表示反馈抑制，“红色实线箭头”表示阻遏作用）
2.2.3 改造转运系统
转运系统关系到终端产物向胞外分泌的程度，相关的在转运基因有mtr、tnaB和aroP，其中aroP可运输L-Phe、L-Trp和L-Tyr，而mtr和tnaB只对L-Trp的转运起作用，有报道显示YddG蛋白也参与了芳香族氨基酸的运输。目前为止，对转运系统改造的报道有很多，研究者大多采用基因敲除或者使相关酶失活的方法来阻止芳香族氨基酸向胞内的转运，如Yanofsky等研究了在大肠杆菌中3个转运基因mtr、tnaB、aroP的失活对L-Trp产量的影响，首次得到当大肠杆菌在酸水解酪蛋白的培养基中培养时，敲除基因tnaB对L-Trp的产量影响最大，接着是mtr，而敲除aroP对L-Trp的产量几乎没有任何影响的重要结论，但当培养基中没有L-Phe和L-Tyr存在时，aroP的失活就会对L-Trp的吸收产生重要影响的重要结论。赵志军通过敲除mtr转运基因，使得L-Trp的产量得到相应提高。古鹏飞对mtr、tnaB和aroP基因进行全敲除，发现对L-Trp的积累有明显的促进作用，并在摇瓶发酵中L-Trp产量可达2.79 g/L。Liu等通过分别在大肠杆菌L-Trp生产菌株和L-Phe生产菌株中过表达yddG基因，发现L-Trp和L-Phe的积累量都有明显的提高。
2.2.4 全局代谢网络
人们在大肠杆菌中发现了一个独特的全局调节系统——Csr，它能通过全局代谢网络来调节CCM途径的碳通量，而这种调节主要是通过一种小RNA结合蛋白CsrA来实现的。CsrA蛋白能正向调节丙酮酸激酶，负向调节PEP羧激酶和PEP合酶，且这3种酶都与前体PEP的合成密切相关，直接影响芳香族氨基酸的产量，除此之外，破坏csrA基因能够增强糖异生和糖原生物合成酶的活性，并减弱EMP途径等。其中，以L-Phe为典型代表，Tatarko等通过在大肠杆菌菌株中敲除csrA基因，并过量表达tktA基因，最终对比原菌株发现L-Phe的产量提高了3.4倍。Yakandawala等分别检测了csrA和csrD突变以及过表达csrB基因对大肠杆菌L-Phe生产菌株的影响，结果表明，过表达csrB基因导致的L-Phe产量明显高于csrA和csrD突变。
2.2.5 菌株生长与产品生产偶联
微生物合成是一种很有前景的方法，可以持续生产工业上重要的产品，很大幅度地提高了产品产量。然而，代谢负担和各种基因操作往往会给菌株带来生产性能限制表型，这是现在生物制造的主要挑战之一。为了解决这个问题，一个优越的策略是将产品合成与细胞生长耦合起来，这使得细胞生存必须生产产品，两者相互依存，缺一不可。Wang等在工程大肠杆菌中创建了一种丙酮酸驱动的代谢方案，用于生长耦合产品生产，从而证明其在促进邻氨基苯甲酸酯及其衍生物生产方面的应用，并促进了两种邻氨基甲酸酯衍生的高价值产品的生产，包括L-Trp，这为提高L-Trp产量提供了很好的借鉴意义。
2.3 芳香族氨基酸高产菌株筛选方法
2.3.1 基于生物传感器的高通量筛选
生物传感器可感知自然界中的众多信息，比如环境变化、危险信号等，此功能在人类发展史上已经得到应用，比如人们会利用狗的嗅觉来帮助查案等。现代生物传感器应用了类似的原理，它可响应并感知被检测对象，并按照一定的规律将感知信号转换成与之对应的易于观察的输出信号，已广泛应用于生物技术和合成生物学中。体内生物传感器作为传感器的一种类型，能够实时感知并响应体内的目标小分子，对代谢工程和代谢网络调控有重要作用。近些年，生物传感器已广泛应用于菌株筛选方面，面对采用各式各样基因手段改造出的菌株，生物传感器可以对改造效果进行高通量且快速的评价，并从中确定出优质菌种。比如，在芳香族氨基酸菌株改造方面，Fang等通过建立L-Trp生物传感器，该传感器调控由L-Trp诱导的tnaCAB操纵子的转录，还可响应代谢途径中产生的L-Trp，为了增强L-Trp代谢途径，引入了InterSPPS策略（以顺序推拉的方式平衡L-Trp代谢途径上游和下游的碳通量），并结合流式筛选技术，筛选到了大肠杆菌性能优质的菌株B8，从而达到提高色氨酸产量的目的。Zhang等开发了一种基于转录调控因子TyrR的L-Phe生物传感器，该装置能够特异地感知胞内的L-Phe，并将L-Phe浓度转化为易于观察的黄色荧光，该荧光信号可利用多功能酶标仪或流式分析仪进行快速测定，从而实现对发酵过程中L-Phe的浓度进行实时监测；利用此元件，他们成功从一个核糖核苷酸结合位点库和一个菌株随机突变库中筛选出了L-Phe高产表型，达到了提高L-Phe产量的目的。Chen等则将CRISPR/Cas9促进的靶基因工程与生长耦联和传感器引导的体内筛选（CGSS）整合在一起，该方法已成功用于工程化一种关键酶——DAHP合酶AroG。二者结合可以更快速地得到芳香族氨基酸的高产菌株。
2.3.2 优化培养基和培养条件
培养基是微生物赖以生长繁殖的环境，主要包括碳源、氮源、无机盐以及维生素、水等，见表5。研究者多采用优化培养基的各组分的方法，使菌种的生长状态达到最佳，进而达到提高芳香族氨基酸产量的目的。
表5 培养基中各组分的优化
张婷婷分别检测了6种不同碳源对菌体生长的影响，结果显示，当以葡萄糖为唯一碳源时，且当葡萄糖的初始浓度为30 g/L时，L-Trp产量可达到最大值。在此基础上，她还检测了多种氮源对菌体生长和色氨酸发酵的影响，发现以酵母粉为有机氮源，以NH4NO3为无机氮源时，菌体的生长量和色氨酸的产量达到最大。娄秀平采用单因素实验和正交实验设计，探究了不同浓度的盐离子对大肠杆菌L-Trp生产菌株的影响，结果表明，6 g/L的KH2PO4和2 g/L的MgSO4为最佳组合。
流加式（fed-batch）培养已经成为一种生产芳香族氨基酸的流行方法，并且还被广泛应用于发酵工程中。在芳香族氨基酸生物合成途径中，底物的抑制作用、终端产物的反馈抑制以及阻遏蛋白的阻遏效应都无法避免，但是采用流加式培养，在一定程度上能够减缓这些不利于芳香族氨基酸生产的负面反应。同时，流加式培养能够更好地控制反应过程中溶氧，既解决了因一次性投放葡萄糖造成的细胞耗氧过多的问题，还能使菌种始终保持正常的生理状态。Jing等通过构建新型动态控制策略，该策略将优化的ANT进料纳入溶解氧（DO-stat）葡萄糖进料框架，实现了大规模生产过程中报道的最高的葡萄糖至L-Trp产量（0.244 g/g），接近最大理论产量0.277 g/g。除此之外，接种量、培养温度、培养基的初始pH以及补料方式等对生产芳香族氨基酸的生产也具有重要的影响。
3 芳香族氨基酸衍生物的生物合成
3.1 L-苯丙氨酸衍生物的生物合成
L-Phe分支途径中的苯丙酮酸和L-Phe在相应酶的催化下可衍生为不同化合物，如扁桃酸、D-苯甘氨酸、D-苯丙氨酸、苯乳酸、苯乙烯、肉桂酸、肉桂醛、肉桂醇等，这些衍生物都具有其独特的应用价值。
扁桃酸主要应用于制药行业，是药物合成的重要前体。扁桃酸的合成主要是由4-羟基扁桃酸合酶（由hamS编码）催化苯丙酮酸完成[图4(a)]。Sun等构建了以葡萄糖为碳源的大肠杆菌菌株，为了提高扁桃酸的生成量，引入了来自A. orientalis的HamS，同时还敲除了竞争途径基因tyrA，经过发酵，S-扁桃酸的产量可达0.74 g/L。接着他又在该菌株的基础上，共表达了来自S. coelicolor对羟基扁桃酸氧化酶（由hmo编码）和来自Rhodotorula graminis对羟基扁桃酸脱氢酶（由dmd编码），得到了0.68 g/L的R-扁桃酸。
苯乳酸在一定程度上能够抑制使食品发生腐败变质的细菌和使人类患病的致病菌的生长，所以其在食品和制药行业中有很大的发展潜力。在乳酸脱氢酶（由ldhA编码）的催化作用下，苯丙酮酸可生成苯乳酸[图4(b)]。Fujita等在高产L-Phe大肠杆菌菌株中表达来自Wickerhamia fluorescens的苯丙酮酸还原酶（由pprA编码），结合发酵条件的优化，最终D-苯乳酸的产量可达29 g/L。
图4 几种芳香族氨基酸衍生物的具体合成途径
Pdh—苯丙氨酸脱氢酶；HamS—4-羟基扁桃酸合酶；LdhA—乳酸脱氢酶；TPH—色氨酸5-羟化酶；TDC—色氨酸脱羧酶；DDC—芳香族L-氨基酸脱羧酶；ASMT—乙酰羟色胺O-甲基转移酶；SNAT—芳烷基胺N-乙酰基转移酶；TnaA—色氨酸酶；Fmo—黄素单加氧酶；TAL—苯丙氨酸解氨酶；TYR—酪氨酸酶
3.2 L-色氨酸衍生物的生物合成
L-色氨酸在相关酶催化作用下可衍生成多种具有独特功能的芳香性化合物，如生长素（吲哚-3-乙酸）、紫色杆菌素、脱氧紫色杆菌素、靛红、靛蓝和血清素等。相比于L-Phe和L-Tyr，L-Trp分支途径中前体较多，所以，提高L-色氨酸衍生物产量是现阶段人们应该关注的焦点。
血清素，又叫5-羟色胺，在动物中可作为神经递质，具有丰富的药用价值，其还可以在相应酶催化下生成具有商业价值的褪黑素。在动物中，L-色氨酸先后由色氨酸5-羟化酶（TPH）和色氨酸脱羧酶（TDC）催化生成血清素[图4(c)]。而在植物中，L-色氨酸先后由TDC和色胺5-羟化酶（T-5H）催化生成血清素。Park等构建了一种重组大肠杆菌菌株，即去除T-5H的N末端，将优化后的T-5H和谷胱甘肽硫转移酶（GST）标签进行融合后共表达，并过表达来自Catharanthus roseus的TDC，结果表明，该菌株可生产24 mg/L的血清素。
靛红和靛蓝被广泛应用在食品、医药和化妆品等行业中，靛红被用于治疗白血病、癌症和阿尔兹海默症等疾病，靛蓝可被用作天然着色剂。以L-色氨酸为起始物，先后经过色氨酸酶、单加氧酶或双加氧酶的催化，可生成互为同分异构体的靛蓝和靛红[图4(d)]。韩晓红等在能够产2 g/L的L-色氨酸的大肠杆菌菌株中，引入来自Methylophaga aminisulfidivorans的黄素单加氧酶（由fmo编码），经过分批培养，得到了920 mg/L的靛蓝和5.0 mg/L的靛红。接着，在该菌株的基础上，加入0.36 g/L半胱氨酸，由于半胱氨酸能够影响Fmo的区域选择性，进而增强了靛红前体2-羟基吲哚的合成，最后通过发酵，靛红产量可达223.6 mg/L。
3.3 L-酪氨酸衍生物的生物合成
以L-酪氨酸和4-羟基苯丙酮酸为前体能够衍生出多种具有重要商业价值的芳香性化合物，如4-羟基苯乳酸、4-羟基苯乙酸、4-羟基苯乙醇、4-羟基苯乙烯、4-羟基苯甲酸、L-多巴、对羟基肉桂酸、咖啡酸、丹参素和黑色素等。
对羟基肉桂酸，又叫对羟基香豆酸，被广泛应用于食品、化工和医药等领域。在苯丙氨酸解氨酶（TAL）的催化下，L-酪氨酸可转化为对羟基肉桂酸[图4(e)]。Yu等构建了一个酵母菌菌株，通过引入一个基于磷酸转酮酶的途径，并替换EMP和芳香族氨基酸合成途径中几个重要基因的启动子，如用SET3p、CDC24p和ALD5p替换PFK1、PFK2和PYK1天然启动子，经过发酵，对羟基肉桂酸的产量可达12.5 g/L。
L-多巴是一种重要的生物活性物质，还是生成儿茶酚和黑色素等的重要中间产物，多被用来治疗帕金森症[图4(f)]。Muñoz等通过在大肠杆菌中引入来自Zymomonas mobilis的环己二烯脱氢酶（由tyrC编码），并同时过表达tktA、aroFfbr、tyrA和tyrC基因，得到了大肠杆菌高产L-酪氨酸菌株，又通过过表达hpaBC基因（编码4-羟基苯乙酸3-羟化酶），实现L-酪氨酸向L-多巴胺的转化，经过发酵，L-多巴产量可达1.51 g/L。
结论与展望
随着社会的快速发展，芳香族氨基酸及其衍生物已经广泛应用于食品、化工、饲料、化妆品和医药等行业，极大提高了人民的生活水平。近年来，现代生物技术、生物信息学、合成生物学以及代谢工程等在提高芳香族氨基酸及其衍生物产量方面也做出了巨大贡献。本文主要从增加前体供给水平、解除关键酶的反馈抑制、消除阻遏蛋白的阻遏作用、敲除或者过表达相应酶基因、菌株生长与生产产品偶联、基于生物传感的高通量筛选、优化培养基和培养条件以及引入外源相关酶等方面总结了提高芳香族氨基酸及其衍生物产量的常用方法，为芳香族氨基酸及其衍生物的进一步发展提供了一定的理论依据。但是，由于各种改造策略涉及的反应机制和代谢途径较为广泛，所以其面临的问题也是多种多样。前体供给中，PEP与E4P供给平衡是一个有待解决的难点，最大程度降低消耗PEP相关酶的活性、在不影响菌株生长情况下去除PTS系统以及增加流向PPP途径的碳通量是提高PEP和E4P供给的一个很好的解决策略；芳香族氨基酸转运系统，则是对其向胞内运输的研究较为全面，向胞外运输的研究却少之甚少，因此更高效的外排芳香族氨基酸也是有待解决的问题，而通过转录组分析挖掘转运蛋白可以有效解决这一问题；高产菌株获取困难，则是因为缺乏快速有效的筛选方式，通过构建特异性的生物传感器并结合液滴微流控以及流式细胞仪可以得到很好的解决。
在过去的十几年里，芳香族氨基酸及其衍生物的生物合成技术已经逐渐趋于成熟，但是大幅度提高芳香族氨基酸产率仍然是研究的热点。对于L-Trp，其生产途径较长，导致其前体增多，因此，就算是现在一些商业化L-Trp生产菌株的产率也很难满足市场的需求；对于L-Tyr，其相关生产技术尚不成熟，导致L-Tyr还没有真正实现工业化生产；对于L-Phe，由于其途径的复杂程度较高，另外，乙酸等副产物积累和糖酸转化率低的问题，都间接影响着L-Phe的产率。对于芳香族氨基酸衍生物，芳香族氨基酸是其主要的前体，提高芳香族氨基酸的产量直接影响着其衍生物的产量。此外，引入外来菌种相关酶的活性低也是影响芳香族氨基酸衍生物产量的一个重要因素。随着一些新技术在合成生物学领域的广泛应用，实现大幅度提高芳香族氨基酸及其衍生物产量的目标指日可待。近年来，有学者结合蛋白质组学和生物信息学的相关理论，采用计算机蛋白设计软件分析酶、改造酶等方法来解除芳香族氨基酸途径中关键酶的反馈抑制。此外，双功能酶的概念逐渐深入人心，它极大地提高了酶的催化效率，部分学者通过对大肠杆菌高产菌株的转录组进行研究，发现SHIK途径中相关酶（比如脱氢奎尼酸合酶、莽草酸脱氢酶）的代谢通量都比较低，严重降低了芳香族氨基酸的产率，Lee等通过在大肠杆菌中引入一种来自木本植物的双功能酶脱氢奎宁酸脱水酶-莽草酸脱氢酶（DHQ-SDH）来提高SHIK代谢通量，从而达到提高芳香族氨基酸的产量的目的。近年来，随着计算机技术的迅速发展，以计算机为辅助工具改造酶的方法也层出不穷，比如AlphaFold算法精准预测蛋白结构的功能为酶改造提供了一个很好的平台，其改造酶的方法有助于解决合成途径中关键酶反馈抑制的问题，有望应用到芳香族氨基酸的改造生产中。代谢工程的发展让人们意识到其对芳香族氨基酸工业化生产的重要性，并且计算机从头设计酶为其提供了一定的技术支撑，为设计新途径提供了一种很好的方法，如Yang等利用C1化合物生产化学品，通过对代谢反应进行计算机分析，并进行动力学评估，构建出了一个新的C1同化途径，最终获得了88%的碳产率。在芳香族氨基酸合成途径中，PEP和E4P合成DAHP的这步反应，主要前体PEP在生成的同时，也会被消耗一部分，可以仿照上述方法构建一个新途径来提高PEP的供给，从而达到提高DAHP的产量的目的。另外，利用计算机设计分析代谢途径和体外反应也是一种新潮的技术。在芳香族氨基酸菌株构建方面，理性改造虽然是芳香族氨基酸高产菌株构建的研究热点，但非理性筛选是高产菌株构建的主流方式，例如定向进化，d'Oelsnitz和Ellington发现连续性定向性进化可以将所有操作无缝集成到一个完整的进化周期中，在精确控制培养参数的同时，还可以在线检测和监控相关参数细胞生长或生产力。至于突变菌株的产生，则可以通过易错PCR和位点饱和诱变等方式在目的基因上进行体外随机诱变。此外，Bryson等与Song等构建了体内全基因组诱变的方法。Song等使用DNA聚合酶-复制子系统（OrthoRep）构建了一种简化的加速定向进化的生物工程学方法。Badran等则使用质粒突变体进行定向进化，可以分别在目的基因上和目的基因外发生突变，这对解决需要同时调节多个基因的多种靶标的问题有很大意义。随着基因靶向技术（例如CRISPR/Cas9技术）的出现，已开发出在特定基因座进行基因工程改造的更精确的技术，例如Jakočiūnas等开发了CasPER，Halperin等则开发了EvolvR。这些前沿技术有望能应用于芳香族氨基酸的生产，为提高其产量和改变其合成途径提供借鉴意义。以L-Trp合成为例，利用计算机分析设计新的高效合成途径以减少碳损失；对合成途径中的关键酶进行定向改造，提高其催化效率；通过新型的多基因碱基编辑技术大幅缩短菌株构建周期，即可在短期内获得转化率与产量显著提高的菌株。虽然只是一种设想，但在目前的技术条件下，具有很高的可行性。期待在不久的将来，随着人们对五大组学研究的不断深入，同时结合生物信息学、结构生物学和合成生物学等的相关理论，可以真正实现芳香族氨基酸及其衍生物高产菌株的快速构建。
通讯作者及团队介绍
张大伟，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员，博士生导师。获2020年天津市科学技术进步一等奖（第一完成人），2020年中国轻工业联合会科技进步二等奖（第一完成人），2018年中国产学研合作“创新奖”。入选2018年天津市科技创新领军人才，2018年滨海新区杰出青年培养计划，并曾获2017年天津市杰出青年科学基金资助。
课题组长期从事工业微生物菌种构建、代谢工程、蛋白表达系统、合成生物技术及相关工业生物技术产品方面研究，多项技术成果已经在企业应用，并产生显著经济效益。主持或参加国家重点研发计划，国家自然科学基金等国家及地方项目20余项。近年来在Nature Communications、Biosensor and Bioelectronics、mBio、ACS Synthetic Biology 等刊物发表文章80余篇，申请专利50余项，获得授权30余项。
