苯甲醇是一种重要的中间体，能用于化学、制药和聚合物工业中许多不同化合物的商业制备。目前苯甲醇的工业生产利用甲苯作为原料，通过化学法生成，该过程繁琐且会生成大量副产物污染环境。因此，如何发展苯甲醇的绿色高效生产方法一直是工业界和学术界共同关注的问题。
近日，湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室李爱涛教授、陈纯琪教授、郭瑞庭教授团队共同合作，成功解决了这一难题。他们首次解析了P450tol及其复合体晶体结构，并基于此构建了一种活性和稳定性均明显提升的人工融合酶，实现了苯甲醇的高效绿色合成，相关研究成果发表于国际权威期刊ACS Catalysis，并选为封面文章 (图1)。
图1.本研究获选为ACS Catalysis封面文章。
万能酶P450的神奇定向进化
在我们生活的地球上，“进化”是一股强大的力量。酶，这种地球上生命中最强大的化学工具，通过理性设计和定向进化手段，展现出了在生物催化领域的强大功能。其中，细胞色素P450酶能够识别多种底物（参与生化反应的物质），利用基因工程改造P450酶来量身定制化学反应，成为一个热门研究方向。2018年诺贝尔化学奖得主阿诺德教授，就是利用P450酶的定向进化实现各种特殊的化学反应而获奖。
惰性C−H键的官能团化被认为是有机化学的圣杯，然而C−H键具有较高的解离能，通常具有较高的热力学稳定性和较低的化学反应性，因此，C−H键官能团化是传统化学合成中一个极大的难题。以重要的工业中间体苯甲醇为例，工业生产采取两步法，以甲苯为原料，需要用到剧毒的氯气和强碱氢氧化钠，并产生有毒副产物 (图2)。
图2.苯甲醇化学合成方法
在前期研究中，湖北大学李爱涛教授从甲苯降解菌中鉴定了一种特殊的P450酶，命名为P450tol，它以甲苯为底物，生成专一的产物苯甲醇，这是迄今发现的唯一可以天然催化甲苯生成苯甲醇的酶。然而，P450tol三维结构信息的缺乏，限制了针对P450tol的基础研究与未来的应用。
揭开特殊P450酶的神秘面纱
要改造高效的P450tol，必须揭开酶结构的面纱。为此，李爱涛教授与郭瑞庭教授团队强强联手。2020年5月，郭瑞庭教授团队成为世界上首次解析自给自足P450酶的全长晶体结构的团队，并获得了广泛的关注和赞誉。这次的强强联手合作，一举解开了P450tol的结构谜团。
在这项研究中，郭瑞庭、陈纯琪团队顺利解析了P450tol的空结构以及与底物甲苯及产物苯甲醇的复合体结构。通过这些结构信息，精准的揭示了P450tol由甲苯通过一步反应生成苯甲醇，且反应没有副产物生成的结构机制。
陈纯琪教授介绍，P450酶的活性区都会带一个血红素分子参与催化反应，他们解析的P450tol也不例外。底物甲苯位于由一系列疏水的氨基酸组成的口袋中，甲苯的甲基朝向血红素中心的铁离子，两个氨基酸(F329和A279)分别位于底物的两侧，牢牢钳住了甲苯的苯环，甲苯前方还有一个氨基酸(V326)负责固定整个甲苯的位置(图3A)，这样催化反应发生时就可以精确的发生在苄基位，而不是其它任意的位置，如此精巧的反应也只有酶可以做到了。另外，他们在P450tol与苯甲醇的复合体结构中也看到了类似的现象，只不过苯甲醇的羟基代替甲苯的甲基朝向血红素中心的铁离子(图3B)”。
此外，他们也观察到了一个非常有意思的现象，甲苯或苯甲醇并不能将P450tol的活性区完全占据，还有一些多余的空间，所以他们猜测P450tol或许可以结合比甲苯或苯甲醇更大一些的底物。复合体结果与他们推测的一致，P450tol也可以与一些卤代甲苯形成复合体，且可以精确的在苄基位发生羟基化反应，所有这些结果都显示，配体会以有利于反应发生的方式结合并参与反应，这也使酶的反应更精准而高效。
图3. P450tol及复合体晶体结构。(A)P450tol与甲苯复合体结构及活性区关键氨基酸；(B)P450tol与苯甲醇复合体结构及活性区关键氨基酸。
人工融合酶实现苯甲醇高效绿色合成
自然界中大部分的P450酶都需要一个能够与之匹配的还原酶来提供电子以发生催化反应，这对于后续的应用是一个难题。为了实现工业应用，寻找天然的自给自足型P450酶或者索性构建高效的自给自足型P450人工融合酶成为科研工作者关注的焦点。
“2020年5月，郭瑞庭团队解析的自给自足型P450酶(CYP116B46)的全长晶体结构，给我们构建自给自足型人工融合酶带来了非常大的启发。”李爱涛教授说，他们将P450tol和CYP116B46的还原酶结构域融合构建的自给自足型人工融合酶 (图4)不论在酶活性、稳定性、还是半衰期都获得了很大的提升。目前，P450tol和CYP116B46的融合是世界上首例报道的稳定性和活性均大幅提升的人工融合酶，有很大的希望应用于实际的工业生产中。
图4.自给自足型人工融合酶P450tol-CYP116B46构建。
不仅如此，P450tol-CYP116B46还可以催化丙基苯在近末端或苄基位区域选择和立体选择羟基化 (图5A)，这些羟基化产物中，有些是非常重要的药物中间体。我们也基于P450tol的三维结构，使用蛋白质工程的手段理性设计和改造，使其反应更多的朝向人类有益的方向发生(图5B和5C)。
图5. P450tol-CYP116B46催化丙基苯(3)羟基化反应。(A)P450tol-CYP116B46催化丙基苯生成的可能的羟基化产物((S)-或(R)-4; (S)-或(R)-5)；(B) 基于P450tol晶体结构与丙基苯分子对接及活性区关键氨基酸；(C)使用HPLC检测P450tol-CYP116B46及突变体羟基化丙基苯的产物。
“在未来的研究领域，随着结构生物学、人工智能、酶定向进化等的大力发展，通过理性设计和改造，获得更多新的具有重要功能的酶来造福于人类，将会是一个重要的研究和发展方向，我们也将继续致力于更多P450tol人工融合酶的构建，期待获得更具挑战的新反应和性能获得极大提升的新酶。”郭瑞庭教授表示。
