吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室的樊占青、刘晓婷、闵伟红*等人选择AK催化中心ATP周围5 Å范围内关键残基丝氨酸（Ser227）位点，进行四突变株的构建，筛选获得高酶活力、性状良好的突变株，并结合分子动力学模拟，对其机制进行分析，旨在为优化AK代谢途径提供参考。
1、ATP结合位点的筛选
通过Discovery Studio软件对AK模型分析，Ser227位点是ATP附近5 Å范围内的关键残基；并且利用Clustal X软件进行同源序列比对，Ser227位点是保守位点，如图1所示。
2、突变株构建
PCR产物经1%核酸电泳验证结果如图2A所示，在7 000 bp处有明亮条带，初步证明成功突变。取定量PCR产物经DpnI酶消化后转入大肠杆菌感受态细胞（BL21）中，经过高通量筛选后获得高酶活力突变株。将突变株活化后进行菌液PCR验证，如图2B所示，在1 000～2 000 bp处有明亮单一条带，与目的基因CpAK长度1 266 bp相符，进一步证明目的基因成功大量复制。将筛选的高酶活力突变株送去测序，结果如图2C所示，Ser227位点由残基Ser突变为残基Asp，最终证明突变株T379N/A380C/G171I/S227D构建成功。
3、SDS-PAGE和Western Blot验证
WT菌株和突变株经IPTG诱导表达目的蛋白，分别进行非变性镍柱纯化，将得到的粗酶样和纯化样进行SDS-PAGE和Western Blot验证，结果如图3所示。在48 kDa处有明显条带，证明AK蛋白表达成功。Western Blot验证结果表明，AK蛋白与抗体（His-tag27E8 Mouse mAb）特异性结合，纯化样是单一AK蛋白。
4、酶动力学分析
测定结果用Origin 9.0软件进行非线性拟合，根据Hill方程V=V max S n /（K n +S n ）得到WT和突变株的最大催化速率V max 。动力学结果见图4、表1，该突变株T379N/A380C/G171I/S227D的K m 值减小为1.35 mmol/L，底物亲和力增大，利于AK与底物的结合，从而提高其催化效率；V max 值为242.05 U/（mg·min），较T379N/A380C/G171I（187.88 U/（mg·min））提高到1.28 倍，较WT AK（ 3.01 U/（mg·min））提高到80.41 倍，表明突变后AK的催化活力显著提高。
5、酶学性质表征
最适温度
由图5A可知，WT AK最适催化温度25 ℃，T379N/A380C/G171I AK最适催化温度28 ℃，该突变株T379N/A380C/G171I/S227D最适催化温度30 ℃，较WT和T379N/A380C/G171I分别提高5 ℃和2 ℃，表明突变增强了AK的耐热性，有效提高了AK的最适温度。当温度高于30 ℃后，该突变株的酶活力仍然较高于WT和T379N/A380C/G171I，说明多次突变有利于AK的耐高温性能的优化。
最适pH值
由图5B可知，WT AK最适pH值为8.0，T379N/A380C/G171I AK最适pH值为9.0，该突变株T379N/A380C/G171I/S227D最适pH值为8.5。与T379N/A380C/G171I相比，该突变株最适pH值降低0.5，耐酸性提高，同时，pH值耐受范围变大，这可能是Ser227位点由中性氨基酸Ser突变为酸性氨基酸Asp的缘故。在pH值为10时，该突变株的酶活力仍然保持在32%，较高于WT和T379N/A380C/G171I。
AK稳定性
相对酶活力下降到最初活力50%所用时间为酶的半衰期。选择最适温度和最适pH值，分别研究WT和突变株的稳定性。如图5C所示，WT AK的半衰期为4.9 h，而T379N/A380C/G171I AK的半衰期为3.1 h，该突变株T379N/A380C/G171I/S227D的半衰期为3.9 h。与WT AK相比，该突变体AK在反应初（0～3 h）和反应末（7～10 h）相对酶活力显著高于WT AK。与T379N/A380C/G171I AK相比，该突变株AK半衰期延长0.8 h，且相对酶活力几乎始终高于T379N/A380C/G171I AK。
底物抑制剂对AK活力的影响
由表2可知，WT AK受Thr和Lys两种抑制剂的协同反馈抑制，而Met对其抑制作用相对较弱。随着Thr和Lys浓度的增加，抑制作用明显增强，当Lys浓度增加到10 mmol/L时，对WT AK的抑制率大约达到39%。当两种抑制剂组合浓度为10 mmol/L时，WT AK抑制率最高为45.04%。当3种抑制剂组合浓度为10 mmol/L时，WT AK 抑制率仅比Lys+Thr组合时高4.15%，再次说明AK受Met抑制作用相对较弱，而主要受Thr和Lys的抑制。
6、突变体的空间结构分析
以构建的AK模型为基础，通过Discovery Studio软件对Ser227位点突变前后与ATP和其周围残基的作用力以及距离变化进行分析。如图6A、B所示，突变前Ser227残基与ATP及周围氨基没有直接作用，突变后，S227D残基侧链向ATP延伸，与ATP和I229残基产生氢键，氢键占有率增加，连接更加紧密，更容易促进催化反应发生，这与Han Caijing等研究报道一致；如图6C、D所示，突变前Ser227残基与ATP距离为2.953 Å，突变后距离缩短为2.562 Å。突变后，距离缩短，作用力增强，从而提高酶活力。
7、分子动力学模拟
如图7A所示，复合物主链C骨架RMSD平均值为0.90 nm，体系在19 ns处达到平衡界点，之后一直平衡稳定于0.9 nm左右，说明体系在整个模拟过程中始终保持稳定状态。R g 是在模拟过程中根据整个蛋白体积和性状计算出的蛋白回旋半径，反映了体系在模拟过程中的柔韧性，如图7B所示，复合物在整个模拟过程中基本平稳，平均R g 收敛于26.66 Å，整个体系柔韧性良好，这可能是由于突变使得蛋白结构发生重排趋于稳定状态。蛋白表面溶剂可及表面积（SASA）是描述蛋白质亲疏水性的重要参数，对蛋白的空间构象及其稳定性具有重要意义，由图7C可知，复合物的模拟轨迹没有较大波动，一直保持平稳，整个模拟过程平均SASA值为222.56 nm 2 ，表明突变使得T379N/A380C/G171I/S227D 的亲水性增强，蛋白表面溶剂的亲和能力增强，从而影响其催化活性，这可能是由于突变后Asp残基侧链像ATP延伸，同时形成氢键。以上3个参数都是在蛋白质整体上进行分析研究，而均方根波动（RMSF）是从整个模拟催化过程单个氨基酸残基的相对波动情况进行分析。由图7D可知，整个模拟过程中，复合物体系都表现出很好的灵活性，利于催化反应。
结 论
本研究对CpAK中催化域ATP周围关键残基Ser227位点进行定点饱和突变，以达到减弱或解除抑制，酶活力显著提高并获得优良多突变株的目的。通过软件Primer Premier 5 进行突变引物设计，以T379N/A380C/G171I AK为模板，经1%核酸电泳验证，成功构建突变株T379N/A380C/G171I/S227D。并将其转入宿主大肠杆菌BL21表达，经SDS-PAGE和Western Blot验证AK成功表达。动力学分析结果表明，该突变株的Vmax较T379N/A380C/G171I提高到1.28 倍，较WT AK提高到80.41 倍，酶活力显著提高，并且与底物的亲和力也明显增大，有利于与底物的结合。酶学性质研究表明：该突变株T379N/A380C/G171I/S227D的最适反应温度增至30 ℃，较WT和T379N/A380C/G171I分别提高5 ℃和2 ℃；最适pH值为8.5，较T379N/A380C/G171I（pH 9.0）减小0.5；半衰期为3.9 h，较T379N/A380C/G171I延长0.8 h；且在不同浓度、不同组合抑制剂存在时，该突变株表现出明显的激活作用，抑制效果减弱显著，相对酶活力最高达143.35%，这与动力学结果相符。同时分子动力学模拟从个体和单个氨基酸残基的变化，其中包括氢键的形成以及复合物系统中的分子间作用力，对酶活力提高进一步说明，为构建高产工程菌提供参考。
本文《新型天冬氨酸激酶突变株构建及酶学性质表征》来源于《食品科学》2022年43卷2期62-69页，作者：樊占青，刘晓婷，魏贞，王哲人，王亚南，高欣，闵伟红。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201126-276。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
