肝素是医学上最广泛的抗凝药物，用于临床血栓、心梗等疾病治疗。目前市场上肝素依赖于猪小肠等动物组织提取。肝素在脊椎动物中发挥着多种作用，如胚胎发育、抗菌 / 病毒感染（如 COVID-19 ）、抗炎症反应和血液凝固等。动物源肝素中其他糖胺聚糖（如过磺酸化硫酸软骨素）的可变结构和污染加剧了医疗风险，阻碍了其结构 - 活性关系的研究。目前，已报道的肝素的合成方法有化学法和化学 - 酶法，但其面临着步骤繁琐或者高成本等障碍。针对现有问题，研究人员开发了一种绿色、简便、易培养的微生物平台合成生物工程肝素，具有与动物源肝素相似的抗凝血活性。
首先，以毕赤酵母为平台菌株实现了双功能酶 N- 脱乙酰 /N- 磺基转移酶（ NDST ）、变构酶和磺基转移酶的活性表达。为进一步提高双功能酶 NDST 活性，通过 N 端截短及融合促溶标签（ MBP ， SUMO 、 TrxA 、 AP2 、 PDI ）等方式，发现 N 端截短 83 个氨基酸及融合 MBP 标签能显著提高 NDST 酶活。 3-L 分批补料发酵，实现了肝素磺基转移酶和变构酶表达量及酶活的进一步提升。在此基础上，建立了全酶法催化合成肝素的技术路线，实现了肝素的酶法催化合成。采用细胞共培养与无细胞催化体系，得到与动物源肝素抗凝血活性相当的生物工程肝素。在毕赤酵母细胞内整合肝素前体合成模块和磺酸化模块，实现了生物工程肝素的从头合成。最后分批补料发酵，以 C1 化合物甲醇为碳源，生物工程肝素产量达到 2.08 g/L 。本研究构建的低成本高效酶法合成生物工程肝素路线，对于促进肝素的生物合成具有重要的意义。
图1 重组毕赤酵母合成生物工程肝素
图2 无细胞体系合成生物工程肝素
图3 工程化毕赤酵母从甲醇中生产生物工程肝素
项目资助
康振教授课题组长期从事糖胺聚糖（肝素、硫酸软骨素、透明质酸等）的微生物合成研究。上述研究得到了国家重研发计划 (2021YFC2100800) 、江苏省杰出青年科学基金 (BK20200025) 、关键技术资助江苏省研发计划 (BE2019630) 的资助。
通讯作者简介
康振 教授
江南大学生物工程学院
从事食品微生物合成生物学与生物制造研究，国家级人才计划入选者，江苏省杰出青年基金获得者，糖化学与生物技术教育部重点实验室副主任。主要承担合成生物学、微生物学课程的讲授工作。近年在Nature Communications、ACS Catalysis、Green Chemistry、metabolic Engineering等主流杂志发表研究论文72 篇，他引1200多次，出版专著（或教材）4 部；授权中国发明专利45 件，美国发明专利4 件；主持包括国家重点研发课题、国家自然科学基金、江苏省科技支撑等在内的省部级纵向与企业横向项目22 项；入选江苏省“六大人才高峰”、济南市“泉城学者”等人才计划，担任江苏省生物技术协会青年专家委员会副主任、中国生化制药协会糖类药物分会第一届专家委员会委员、BMC Biotechnology 副编辑、Enzyme and Microbial Technology、Frontiers in Bioengineering and Biotechnology、Biotechnology Letters杂志编委，中国化学学会会员、中国微生物学学会会员。相关糖胺聚糖及其寡糖等多项微生物生产技术已经实现产业化，所构建枯草芽孢杆菌的食品级表达系统已经被国际知名的MoBiTec GmbH公司商业化。
李江华 教授
江南大学生物工程学院
长期从事发酵工程和酶工程等领域的研究，主要承担《发酵工程原理与技术》、《酶工程》等课程的讲授工作。联合发表SCI论文200余篇；授权发明专利80余项；主持包括国家重点研发计划、国家自然基金、863项目课题等在内的国家及省部级科研项目6 项；获得国家技术发明二等奖、教育部科技进步二等奖、中国轻工业联合会技术发明和科技进步一等奖等在内的省部级或行业协会奖励6项。享受国务院特殊津贴；受聘为中国食品科技学会有机酸分会理事。
