萜类化合物的生产方式包括植物提取法、化学合成法和生物合成法。植物提取法产量受气候、季节影响较大，提取过程易对天然资源造成破坏，且分离效果不佳、产量极低。以瓦伦西亚烯为例，以西柚皮为原料进行提取，获得率仅为 0.2-0.6%；化学合成法则能耗高、污染大且产物非天然。通过对微生物细胞进行特定改造并利用细胞工厂异源合成萜类化合物，将有望成为替代植物提取和化学合成的一种更好的策略。
酿酒酵母是目前研究最为广泛的微生物底盘细胞之一，但作为 Crabtree 阳性菌株，当以葡萄糖为碳源时，其溢流代谢导致副产物乙醇代谢通量过高而生物质得率较低。非发酵碳源则可有效维持细胞线粒体的完整性，从而最大程度限制乙醇的刚性通量，保障萜烯生物合成所需的高能耗和辅因子平衡。
近日，华南理工大学生物科学与工程学院 李爽 教授作为通讯作者在 Green Chemistry 杂志（IF=10.18）上发表了一篇题为“ Efficient utilization of carbon to produce aromatic valencene in Saccharomyces cerevisiae using mannitol as substrate ”的研究论文。该论文首次报道了以酿酒酵母为底盘细胞，非发酵碳源甘露醇为唯一碳源，构建高附加值倍半萜类香料——瓦伦西亚烯的高效细胞工厂，证明了海藻源碳源在酿酒酵母高产萜类化合物中的潜力。博士研究生 朱晁谊 为该文第一作者。
李爽 于 1997 年保 送进入清华大学化学工程系，本科期间表现优异。因高中参加生物奥赛的经历，她在保研时选择了生物化工这一细分领域作为研究方向。彼时，生物化工尚属新兴学科，前途充满未知，这一“冒险”行为，全凭李爽对生物的一腔热爱。读研期间，她接触到了当时还研究较少的酶分子定向进化技术。2001 年李爽获得直博机会继续深造。2006 年博士毕业后，她先在企业工作一年，之后进入华南理工大学工作至今。
▲图丨李爽教授（来源：受访者提供）
“将学习到的工程化的理念与生物学知识融会贯通，对打造微生物细胞工厂更有帮助，也让我更加清楚如何实现产品的产量和产率的提升。” 李爽 说。
非发酵碳源的利用使瓦伦西亚烯产量提高 3 倍
瓦伦西亚烯（Valencene）是一种具有柑橘香气的高值倍半萜类化合物，被广泛应用于食品、化妆品行业，年市场需求量超过 10,000 kg。
最初， 李爽 团队曾以葡萄糖为碳源生产瓦伦西亚烯，并尝试通过各种代谢途径改造或者酶工程改造来提升限速步骤的代谢能力，但底物转化效率不佳。通过进一步的理论分析， 团队认为改变碳源或许是解决方案之一。
然而，寻找合适的非发酵碳源着实让团队花费了不少心思。
团队首先放弃了业内经常选用的非发酵碳源 —— 木糖，原因是木糖作为纤维素来源的生物质，始终不能摆脱与人争地的问题。另外，酿酒酵母自身由于缺乏木糖代谢途径中将木糖转化为木酮糖的酶而不能利用木糖，需要外源引入自然界天然存在的木糖代谢路径，这种人工导入的路径想要高效地发挥功能，前期需要做大量的工作。
乙醇是另一个常见的碳源选项。不过，乙醇具有易燃易爆性，需要进行安全控制，在产业化路径中，需要甲类车间进行生产，增加了生产的投入成本。考虑到这一方面，团队又放弃了乙醇。
至此， 李爽 团队想要开发新一类候选碳源，既能解除 Crabtree 效应，又具有足够的安全性。经过多方调研，目光最终聚焦在资源丰富且生长迅速的海洋植物上。海藻类的碳源构成以葡萄糖和甘露醇为主。
经考量，甘露醇正是她们所寻找的 “理想碳源”。
甘露醇是非发酵碳源，还有关键的一点是，酿酒酵母本身具有甘露醇的代谢模块。只不过，自然状态下，该代谢模块呈关闭状态，即天然酵母无法利用甘露醇进行生长。
那么， 李爽 团队想，只要找到这一代谢模块的开关，问题就能够解决。
该研究从理论代谢网络基元计算出发，模拟出甘露醇高效生产瓦伦西亚烯的代谢灵活性，即理论上证明该思路确实可行。
▲图丨该项研究的整体思路（Graphical Abstract）（来源：受访者提供）
具体操作则分为两个阶段，第一阶段是实现 0-1 的突破，第二阶段则是实现 1-100 的优化过程。
模拟自然界的进化过程，施加定向压力，让野生型的酿酒酵母菌株在甘露醇为唯一碳源的培养基中进行培养，适者生存，能够利用甘露醇生长的突变体慢慢凸显出来，最终存活下来的即为目标菌株。不过，获得的菌株生长非常缓慢，需要进一步驯化。接下来，团队通过不断地传代，提升其生长速率。
经过 1500 多小时的适应性实验室进化（Adaptive laboratory evolution，ALE），突破了天然酿酒酵母对甘露醇的利用瓶颈，获得了具有优越甘露醇代谢能力的酿酒酵母菌株 BN-91A。
▲图丨酿酒酵母中甘露醇同化与瓦伦西亚烯合成原理图（来源：研究论文）
相比葡萄糖碳源，以甘露醇为唯一发酵碳源，瓦伦西亚烯的产量和 C/C 转化率分别提高 3 倍和 5 倍。基因组和转录水平分析揭示，甘露醇代谢为瓦伦西亚烯合成相关基因的转录和翻译提供了更有利保障。通过合成生物学代谢调控手段，进一步优化前体供应、底物摄取速率及辅因子再生等，在 3 L 发酵罐实现瓦伦西亚烯产量 5.6 g/L。
“一般认为萜类化合物达到克 / 升的产量就有产业化的潜力，目前我们实验室所能达到的实际产量还要高于文章发表的数据，现在正在与一些公司接洽，希望能够尽快地推动相应的技术产品落地。” 李爽 告诉生辉 SynBio。
已着手打造更多萜类化合物的细胞工厂
通过对获得的目标菌株进行基因组测序， 李爽 团队发现，利用甘露醇的酿酒酵母菌株的出现是因为一个关键因子 TUP1 发生突变。TUP1 相当于一个开关，使得甘露醇代谢相关的元件自然情况下呈关闭状态。
“我们曾试图通过对 TUP1 单基因进行突变获得目标菌株，虽然能够实现，但是其生长速率略慢于诱导进化获得的一代菌株。用自然进化的方法获得的菌株，其鲁棒性、效率、效能方面都要好很多。”
“不过，与以葡萄糖为碳源相比，其生长速率仍有一定差距，接下来，我们希望进一步提升酵母菌株以甘露醇为碳源的生长速率，能够实现从 100 到 1000 甚至是 10000。”
李爽 表示，团队将从分子代谢水平上进行分析改进，适应性进化手段已经不太能够满足生长速率提升的需求；同时还将进一步拓展其他可利用的海洋类碳源。希望最终实现萜类化合物以海洋类碳源为基础的生产工艺的全过程开发。
▲图丨酿酒酵母葡萄糖和甘露醇代谢网络的基本模式分析（来源：研究论文）
李爽 还告诉生辉 SynBio，该研究的重要意义除了实现高值香料瓦伦西亚烯的高效生产之外，还具有另外一个潜在意义，那就是能够基于此研究进一步生产更高价值的圆柚酮。
瓦伦西亚稀是圆柚酮的前体，二者都是倍半萜类化合物，也都是柑橘香型的一类化合物。圆柚酮在植物中的含量比瓦伦西亚烯更低，提取一公斤的圆柚酮预计需要 40 万个西柚。
“圆柚酮也是我们课题组主要关注的萜类化合物，其未来将具有更广泛的应用价值。” 李爽 说。
2020 年，美国环保局（EPA）和美国疾病控制与预防中心（CDC）已批准圆柚酮作为杀虫剂或者说防蚊剂的使用。目前，市面上的驱蚊剂主要是避蚊胺类化合物，其安全性具有较多争议，尤其是在婴幼儿身上使用受限。圆柚酮在没有安全性方面的顾虑的同时，其防蚊虫的能力还要优于避蚊胺两到三倍。近两年，也有将圆柚酮作为药物生产的相关研究。
以植物提取的瓦伦西亚烯作为前体，再利用化学法，以酶或者重金属催化氧化成圆柚酮，是圆柚酮的生产路径之一。
“我们通过酵母细胞工厂高产瓦伦西亚烯，再用酶法或者直接全细胞从头合成圆柚酮，同样可以满足天然和双碳的要求。目前课题组正在做提升从瓦伦西亚烯到圆柚酮的转化效率的工作。同时，我们也已经打通了以酵母菌株利用甘露醇、海带水解液生产圆柚酮的路径。预计很快将有新成果发表。”
最后， 李爽 还透露，团队 已经在打造其他萜类化合物的细胞工厂。“通过对瓦伦西亚烯生产通路的成功构建，我们在酿酒酵母基因操作、高通量筛选平台的建设以及酵母表达水平的精细调控等方面已有相应技术积累，希望能够在其他萜类化合物的产品生产中有比较好的表现。目前有三个项目在同步推进。”
参考文献：
1. http://html.rhhz.net/SWJSTB/html/2017-1-64.htm
2. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/GC/D2GC00867J
