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蓝藻和紫色光合细菌在可持续工业生产方面前景较好

   日期:2022-08-17     来源:生辉    浏览:1308    评论:0    
核心提示:2021 年,韩国高丽大学的研究人员将来自 C. necator 的异源 phaCAB 基因引入快速生长的蓝藻 S. elongatus UTEX 2973(其没有天然的 PHB 生产途径),得到了一个在光自养生长下生产 PHB 高达 420 mg/L(占其生物量重量的 16.7%)的菌株。 德国科学家 Karl Forchhammer 和合作者使用 Synechocystis sp. PCC 6803 pirC 突变株 ΔpirC 开发了一个最大化 PHB 生产的策略。通过将异源 phaCAB 基
  
 PHA 是由微生物利用多种碳源发酵产生的高分子聚酯的总称,这种以细菌为基础的可生物降解塑料是碳中和大背景下的一大热门方向。如今,由于具有良好的生物相容性、生物可降解性和热加工性能,PHA 在塑料包装、化工、医药、农业、生物能源等多个领域具有广泛应用。

1926 年,法国学者 Lemoigne 在巨大芽孢杆菌中发现了 PHB 积累物。20世纪 80 年代,奥地利公司 Chemie Linz AG 最早实现 PHB 的商业化。自那之后,PHA 逐步开始产业化。

在国内,布局 PHA 的公司主要包括中粮科技、天津国韵生物、北京蓝晶微生物、深圳意可曼、宁波天安生物、北京微构工场、广东荷风生物、珠海麦得发等。

根据此前生辉的采访及前瞻产业研究院的报告,蓝晶微生物新一轮融资开始建设 PHA 量产基地,总产能规划为 10 万吨,分三期建成,其中 5000 吨的一期生产线将在 2022 年内建成投产;微构工场也于 2021 年 6 月完成 200 吨的 PHA 装置投产,并且在7月利用得到的 PHA 成功制成纤维纺。天津国韵生物科技有限公司、绿塑科技等均已建成万吨级 PHA 生产基地。

这些公司所使用的底盘细菌各不相同。其中,蓝晶微生物选取油田土壤中的耐油细菌进行工程化改造后合成产出 PHA;北京微构工场则是改造嗜盐菌作为底盘细菌,完成PHA的工业化生产。

事实上,除了这些异养细菌外,一些自养微生物也被看作有前景的 PHA 生产平台。

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▲图丨不同类型微生物营养生长模式的总结(来源:Polymer Journal)

自养微生物根据能量来源不同,分为光养生物和化能自养生物,前者的能量来源是光,后者则是无机电子供体。它们的共同点是能够从无机物合成有机物过程中,获得本身生命活动所需养料和能量的生物。在光养生物中,蓝藻紫色光合细菌用于生产 PHA 已被广泛研究。

 

蓝藻生产 PHA 的研究进展

 

PHA 是一类由(R)-羟基烷酸单元组成的聚酯。蓝藻中最常见的 PHA 聚合物是聚 [(R)-3 羟基丁酸酯] (PHB)。

与所有蓝藻中保守的糖原代谢不同,只有少数蓝藻属,如 Nostoc、Arthrospira、Synechocystis和Synechoccus,自然合成 PHB 作为额外的细胞碳储存。

与 Capriavidus necator(主要的 PHA 生产者)自然积累高水平的 PHB(约占其生物量重量的 70%)不同,蓝藻积累的 PHB 量较低(约为其生物量重量的 4.1%)。它们之间的差异之一是 PHA 合成酶(PhaC)的形式,它是 PHA 生物合成中的关键酶。在蓝藻中,PHB 是由 III 类 PHA 合酶合成的,该类合成酶由两个亚基 PhaC 和 PhaE 组成。

来自 RIKEN 可持续资源科学中心的日本科学家 Keiji Numata 与合作者利用无细胞合成法,证明了蓝藻的低 PHA 生产率不是由于 PHA 合成酶的活性,可能是由与 PHA 合成有关的其他途径引起的。

一些遗传操纵策略已被应用于提高蓝藻的 PHB 产量。来自 RIKEN 可持续资源科学中心的研究者在 Synechocystis sp. PCC 6803 中过量表达 RNA 聚合酶 σ 因子 sigE,导致从糖原开始的代谢途径发生改变,从而在氮饥饿条件下提高 PHB 产量。PHB 产量达到 14 mg/L(占其生物量的 1.4%),与对照菌株相比,显示出 2.3 倍的增长。

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(来源:SingularityHub)

在另一项研究中,日本茨城大学农学院的研究者在 Synechocystis sp. PCC 6803 中使用高拷贝数载体过度表达用于 PHB 生物合成的内源 pha 基因,成功地提高了 PHB 产量,达到10.59 mg/L(占其生物量重量的7%),与对照菌株相比,产量增加了 12 倍。

此外,维也纳工业大学的研究人员利用紫外线辐射的随机诱变法获得了高产 PHB 的 Synechocystis sp. PCC 6714 菌株,诱变后的菌株可以产生高达其生物质重量 37% 的 PHB,与野生型相比,在光自养生长下,PHB 产量增加了 2.5 倍以上。

2021 年,韩国高丽大学的研究人员将来自 C. necator 的异源 phaCAB 基因引入快速生长的蓝藻 S. elongatus UTEX 2973(其没有天然的 PHB 生产途径),得到了一个在光自养生长下生产 PHB 高达 420 mg/L(占其生物量重量的 16.7%)的菌株。

德国科学家 Karl Forchhammer 和合作者使用 Synechocystis sp. PCC 6803 pirC 突变株 ΔpirC 开发了一个最大化 PHB 生产的策略。通过将异源 phaCAB 基因引入 Synechocystis sp. PCC 6803(ΔpirC),所产生的菌株产生的PHB达到其生物质重量的 61%,这意味着在光自养生长下,PHB 产量比野生型增加约 6.1 倍。证明了蓝藻在 PHB 可持续工业生产方面的潜力。

 

紫色光合细菌生产 PHA 的研究进展

 

基于无氧紫色光合细菌(PPB)的代谢多样性和同化二氧化碳的能力,可以将它们发展为自养细胞工厂,生产广泛的生物产品。稳健性和多变的新陈代谢,使它们能够使用各种碳源,已被广泛研究用于废水处理和资源回收。

然而,与微藻和蓝藻相比,基于 PPB 的生物生产由于遗传工具和基因组数据的可用性而受到的关注较少。过去的几年,许多研究已经证明了 PPB 可以作为有价值的生物产品的光合生产平台,包括异源生产植物来源的生物活性化合物,如 R. sphaeroides 中的蒎烯(单萜),R. sphaeroides 中的瓦伦烯(一种倍半萜香气化合物),以及 R. Rhodobacter capsulatus 中的 botryococene(一种三萜烃)。

PPB 可以通过有效的二氧化碳固定 CBB 循环(Calvin Benson Bassham,光合作用中的碳固定途径)将二氧化碳固定到细胞中。它也被提议作为一个生产生物聚合物的光合自养平台。已发现一些 PPB 菌株在碳储存过程中自然积累 PHA 生物聚合物。

淡水 PPB R. rubrum 是一种经过充分研究的 PPB,因为它能够同时产生 PHA。在光合作用的限氮条件下,R. rubrum 可以积累高达其生物量 50%的 PHA。它在光自养条件下将合成气(以一氧化碳和氢气为主要组分)转化为 PHA 的能力也得到了广泛的研究。尽管一氧化碳(CO)对大多数生物有毒性,但 R. rubrum 有能力在厌氧条件下利用合成气中的 CO 作为唯一的碳源和能量来源。

西班牙的科学家的研究表明,在补充醋酸的合成气发酵过程中,R. rubrum 在光照和黑暗条件下积累的PHA高达其干重的 20%。

此外,西班牙的研究人员测试了 R. rubrum 利用由微波热解生活垃圾获得的合成气作为 PHA 生物合成的原料的潜力。通过使用从微波诱导热解获得的合成气,并补充微量的醋酸,发酵 R.rubrum,获得了高达其干细胞重量 16% 的 PHA,CO 转换效率约为 37%。

除了淡水 PPB R. rubrum,海洋 PPB 也被提议作为可持续生物生产的理想微生物宿主,因为它具有多种潜在优势,例如代谢的多样性和高耐盐性,可以在大规模培养过程中消除生物污染。

目前已有相关研究验证了海洋 PPB 在细胞内自然生物合成和积累 PHA 的能力。在测试的菌株中,Rhodovulum euryhalinum、Rhodovulum imhoffii、Rhodovulum visakhapatnamense和Rhodovulum sulfidophilum 被报道在光自养培养条件下会自然积累一些 PHA。


 

▲图丨A. 限氮培养基下 R. visakhapatnamense 菌胞内 PHA 颗粒的 TEM 图像;B. 从海洋紫色细菌 R. sulfidophilum 和代表性纤维中生产 MaSp1-(6-mer) 人工蛛丝蛋白(来源:Polymer Journal)

在海洋 PPB 群体中,R. sulfidophilum 因其生物合成 PHA 的能力和作为生物聚合物生产宿主的潜力而被研究得最多。例如,改善培养条件以提高 R. sulfidophilum 的 PHA 积累量。研究培养物中盐和铁浓度对其 PHA 积累的影响发现,最佳铁浓度(~1-2 μM)对于促进细胞生长至关重要,获得最高的 PHA 积累量,干生物量含量为 32.4 wt.%。

今年 1 月,日本科学家 Keiji Numata 与合作者在 ACS Synth. Biol.上发表了题为Engineered Mutants of a Marine Photosynthetic Purple Nonsulfur Bacterium with Increased Volumetric Productivity of Polyhydroxyalkanoate Bioplastics 的文章,通过采用全基因组诱变和高通量筛选,对 R. sulfidophilum 菌株进行了改进。使用这种方法,改良菌株的 PHA 产量增加了 1.7 倍,同时也比原始菌株更快地积累 PHA。

然而,由于光异养条件更适合 PHA 积累,因此在光合自养培养条件下由 R. sulfidophilum 生产 PHA 仍然极具挑战性。最近应用工程纳米粒子来促进微生物细胞工厂的发展引人注目。有研究表明,与未添加纳米凝胶颗粒的对照相比,在 R. sulfidophilum 光合自养培养中使用工程纳米凝胶颗粒成功地将 PHA 积累提高了 157 倍。使用工程纳米凝胶颗粒策略的好处是,在不允许或因生物安全法规而难以将改性微生物的基因用于实际生产的地方,能够实现 PHA 的生物生产。然而,这种策略并不是要取代其他策略(如通过基因改造来设计代谢途径),而是对其进行补充,以协同地进一步提高生物炼制效率。

遗传修饰策略也被用于改进 PPB 菌株以靶向有价值化合物的生物生产。通过代谢工程改造 R. sphaeroides,破坏了一个聚(3-羟基链烷酸酯)解聚酶(phaZ)基因,同时过度表达PHB生物合成基因的特定异构体(乙酰转移酶,phaA2;乙酰乙酰辅酶 A 还原酶,phaB2;和聚(3-羟基链烷酸酯)聚合酶,phaC1),提高了 PHB 生产产量达 1. 88±0.08 g·L-1(约占其生物质重量的 79%)。

此外,高效的基于 Cas9 的基因组 DNA 靶向系统已成功用于阐明淡水 PPB R. sphaeroides中 PHB 生产途径中的必需基因。所开发的工具被用于阐明 R. sphaeroides中PHB 生产方面的遗传信息,并构建了 PHB 生产能力大幅降低但不影响生长的突变株。这是将代谢流从 PHB 重定向到其他所需代谢物的一种可能策略。

除了 PHA 碳聚合物外,通过将 Nephila clavipes 的 MaSp1 基因引入 R. sulfidophilum,在光自养生长条件下,也成功地生产了一种蜘蛛丝蛋白聚合物。这项研究拓展了利用 PPB 生产除自然合成的生物聚合物以外的异源生物聚合物的可能性。

目前,由于生产效率的问题,在自养条件下进行的 PHA 生产研究仍然是有限的,高昂的成本也阻碍了其商业化应用的脚步。不过,其生产前景值得期待。

 
     
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