近日，中国科学院昆明植物研究所黄胜雄课题组解决了长期遗留的可卡因托品烷骨架构建的世纪难题，再次阐明了经典的Robinson托品酮全合成是仿生合成，相关研究成果以“Discovery and Engineering of the Cocaine Biosynthetic Pathway”为题发表在Journal of the American Chemical Society（https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c09091）上。
正文
托品烷生物碱（tropane alkaloids）是一类由吡咯环和哌啶环骈合为托品烷基本骨架的生物碱，代表性成员莨菪碱和可卡因是具有悠久的药用历史，且目前仍在临床上广泛使用的重要天然药物。莨菪碱作为毒蕈碱型乙酰胆碱拮抗剂，用于镇痛、止痉挛、治疗帕金森症等；可卡因作为第一个被发现的局部麻醉药，衍生出临床上现今绝大多数的麻醉药，成为了药物化学中麻醉药改良最经典的教学案例。2018年，鉴于可卡因不可替代的麻醉优点，被FDA批准为口腔和鼻腔外科手术的局麻药。
1917年，Robinson利用丙酮二羧酸（OGA）合成托品酮的一锅法反应是写入教科书中天然产物全合成的第一个经典案例，长久以来被大多科学家坚信为仿生合成。2019年，本课题组从茄科植物中鉴定出催化OGA形成的聚酮合酶，为Robinson的化学合成是仿生合成提供了直接的证据（ Nat. Commun. , 2019 , 10 , 4036.）。今年，黄胜雄课题组从古柯科植物中再次鉴定出催化OGA形成的聚酮合酶，而OGA可与 N -甲基吡咯鎓离子自发缩合形成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸（MPOA），作为可卡因托品烷骨架的形成前体（ Nat. Commun. , 2022 , 13 , 4994.）。
在古柯中，已报道的同位素前体标记实验显示：4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸甲酯（MMPO）可插入到可卡因中。基于此， 化学家们 提出了盛行的可卡因托品烷骨架形成假说：MMPO作为可卡因的生物合成中间体，其经氧化环化后形成甲基芽子酮（即MPOA先甲基化，后氧化，图1A）。为了验证这一猜想，黄胜雄课题组克隆和表达了古柯中大量的甲基转移酶和氧化酶，但都无法有效地催化MPOA甲基化生成MMPO，以及催化MMPO氧化环化为甲基芽子酮（methylecgonone），故而对盛行的可卡因托品烷骨架形成假说提出了质疑。
图1A. 可卡因托品烷骨架合成途径；图1B. 经典的Robinson托品酮化学全合成（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
随后，黄胜雄课题组大胆地提出了另一种托品烷骨架形成假说：MPOA先氧化为极其不稳定的芽子酮（ecgonone），而后甲基化为甲基芽子酮（图1A）。为了验证这一猜想，在烟草中同时表达候选的氧化酶和甲基转移酶被认为是最佳的筛选方式。当氧化酶CYP81AN15和甲基转移酶MT4共表达时，发现喂养的MPOA被转化为甲基芽子酮，说明这两个酶一起工作就能合成甲基芽子酮，从侧面也说明了新提出的大胆假设的正确性。为了更加明确氧化酶CYP81AN15和甲基转移酶MT4的功能，对酶CYP81AN15和MT4进行体外逐步反应是验证该假设最直接和有效的实验证据。但是，怎么获取和检测不稳定的芽子酮产物是最大的难题。作者仔细分析了Robinson百年前的经典托品酮合成的机制：丁二醛与甲胺经过两次类Mannich环化后形成的潜在中间体是一个具有托品烷骨架的二酸，该二酸脱羧一次后就是芽子酮，再次脱羧后形成托品酮（图1B）。随后作者温和地重复并处理了Robinson的经典托品酮化学反应，通过LC-MS检测到了二酸中间体和芽子酮中间体，证实了其反应机制和反应中间体。随后通过温和地处理Robinson的经典托品酮合成反应，分离纯化并首次通过NMR表征了不稳定的芽子酮标准品。进一步通过体外酶促反应显示：甲基转移酶MT4可催化芽子酮甲基化生成甲基芽子酮，而温和地处理氧化酶CYP81AN15氧化MPOA的酶反应，作者首先检测到的是芽子酮，随着时间的推移芽子酮自发脱羧生成托品酮。故而确证了作者大胆的假设并纠正了长期存在的但不正确的MPOA先甲基化后再氧化的猜想，最终阐明了可卡因托品烷骨架的形成过程（图1A）。
在可卡因的生物合成中，其托品烷骨架是具有光学手性的，但OGA与 N -甲基吡咯鎓离子自发缩合而成的MPOA ( 3 )却是消旋体。因此，对氧化酶CYP81AN15和甲基转移酶MT4的底物手性选择性进行表征，发现（图2）：氧化酶CYP81AN15只催化 S -MPOA ( S -3 )氧化为(+)-芽子酮( 7 )；甲基转移酶MT4只催化(+)-芽子酮( 7 )甲基化为(+)-甲基芽子酮( 5 )。故而解决了可卡因生物合成路径中从消旋MPOA到手性托品烷骨架形成的疑惑。
图2. 可卡因中托品烷骨架的生物合成途径（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
基于以上研究结果，利用氧化酶CYP81AN15和甲基转移酶MT4，以及四个已鉴定的功能酶（PMT1, PKS1, MecgoR和CS）在烟草中组建了可卡因最简生物合成路径，最终实现了可卡因的从头合成（图3），这标志着一条接近完整的可卡因生物合成途径的揭示。该研究结果也预示着在不久的将来可以通过合成生物学在酵母或大肠中实现可卡因的异源生产。
图3. 可卡因生物合成路径在烟草中从头构建（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
总结
中国科学院昆明植物研究所黄胜雄课题组对氧化酶CYP81AN15和甲基转移酶MT4的发现及功能表征，纠正了长期存在的但不正确的可卡因托品烷骨架形成的猜想，解决了可卡因托品烷骨架构建的世纪难题，实现了可卡因在烟草叶片中的生产；其中，作者巧妙的通过Robinson合成托品酮反应制备芽子酮标准品，用于检测和验证氧化酶CYP81AN15催化产物及功能；此外，Robinson合成托品酮的反应中芽子酮中间体的分离再次阐明了经典托品酮化学全合成的仿生合成之美。
文献详情：
Yong-Jiang Wang, Jian-Ping Huang, Tian Tian, Yijun Yan, Yin Chen, Jing Yang, Jianghua Chen, Yu-Cheng Gu, Sheng-Xiong Huang*. Discovery and Engineering of the Cocaine Biosynthetic Pathway. J. Am. Chem. Soc . 2022 , https://doi.org/10.1021/jacs.2c09091
