华南理工大学食品科学与工程学院的肖 寒、刘秀妨、黄明涛*等在国内外最新研究进展的基础上，对溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶的结构特征、水解机理、生产现状和实际应用等进行归纳总结，并对其未来的研究方向进行展望，以期能够为微生物源胶原蛋白酶的进一步开发和利用提供参考依据。
1、微生物源胶原蛋白酶结构特征
微生物源胶原蛋白酶通常具有多个结构域（图2），分别是前肽、激活结构域、肽酶结构域、PKD和CBD。按照其功能又可将激活结构域和肽酶结构域归为催化功能模块，将PKD和CBD归为胶原募集模块。胶原募集模块的差异也是不同菌种来源的胶原蛋白酶在结构差异性上的重要体现。
胶原募集模块中的CBD可特异性地识别结合胶原蛋白的三股螺旋结构，是胶原蛋白酶水解不溶性天然胶原蛋白的重要结构，其倾向于结合在胶原蛋白三股螺旋较松散的部分。PKD与胶原蛋白的结合不紧密，但可以进一步强化CBD与纤维状胶原蛋白的结合能力。如图3所示，ColG含有两个串联CBD和一个PKD，Ca2+的存在可以使ColG中两个CBD之间的连接部分由α-螺旋转变为β-折叠，增强CBD与胶原蛋白的结合，也使其不易被其他蛋白酶水解，提高了全长胶原蛋白酶的稳定性。ColH含有一个CBD和两个PKD，CBD可以沿着胶原蛋白纤维滑动，找到更容易水解的位点，两个PKD的存在使其对胶原蛋白的亲和力更强。根据这一结构特征，二者可协同水解胶原蛋白，即ColG先锚定在胶原蛋白纤维最脆弱的区域使原纤维溶胀，ColH结合在这些溶胀的区域进行水解
2、胶原蛋白酶的水解机理
2011年，Eckhard等首次对胶原蛋白酶ColG进行整体晶体结构解析，并通过分别异源表达该酶各个结构域推测其水解胶原蛋白和微原纤维胶原蛋白（由5 条三股螺旋缠绕而成）的机理，大致分为以下3 个步骤，如图4所示。
首先胶原蛋白酶的肽酶结构域与胶原蛋白三股螺旋结合（图4A）；此时胶原蛋白酶处于开放状态，激活结构域未与底物相互作用，胶原蛋白尚未发生水解；随后胶原蛋白酶闭合，激活结构域与三股螺旋发生相互作用（图4B）。水解过程中，胶原蛋白酶渐渐打开成半开放构象，使3 个α-链解旋并依次降解（图4C）。在三股螺旋被彻底水解后，胶原蛋白酶便恢复至初始开放状态，进行下一轮水解。对于由5 条三股螺旋缠绕形成更为复杂的微原纤维胶原蛋白，水解步骤也大致相同，但每次只水解一个三股螺旋胶原蛋白，其余部分被排到酶外等待下一次水解（图4D～F）。
3、胶原蛋白酶活力检测方法
胶原蛋白酶的酶活力检测方法主要有平板法、显色法和荧光法等。
平板法可用于初步筛选具有胶原蛋白水解活性的菌株。具体方法是将具有胶原蛋白酶活性的菌株在明胶平板上进行培养后，用酸性汞试剂处理平板，未被降解的明胶变性沉淀，可观察到菌落周围出现水解圈，通过水解圈与菌落直径比值的大小可以初步判断该菌株分解胶原蛋白能力的强弱。该方法操作简便，可用于初步鉴定胶原蛋白酶水解活性，但是水解圈大小根据观察时间不同而有所区别，且灵敏度较低，多用于定性检测。
显色法中，茚三酮显色法是一种常规的胶原蛋白酶酶活检测方法，通过酶水解底物释放至体系中游离氨基酸的含量来表征胶原蛋白酶的水解活力。该方法通常以可溶性胶原蛋白、不溶性胶原蛋白和变性胶原蛋白明胶等作为底物，以甘氨酸或亮氨酸的生成当量来定义酶活力单位U。
除了以天然或变性胶原蛋白为底物，一些人工合成的特异性底物也常用于胶原蛋白酶活力的检测，如Azocoll、FALGPA（N-(3-[2-furyl]acryloyl)-L-leucylglycyl-L-prolyl-L-alanine）和Pz-PLGPA（PZ-L-prolyl-L-leucyl-glycyl-L-prolyl-D-arginine）等。Azocoll是一种与偶氮染料连接的胶原蛋白，被胶原蛋白酶水解后染料释放，可通过测定520 nm波长处吸光度来计算酶活力。FALGPA和Pz-PLGPA是人工合成的胶原蛋白酶寡肽底物，不易被其他蛋白酶水解。
除了这些常见的底物，Saikumari等合成了一种新的荧光底物，能专一地被溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶切割而不受其他蛋白酶影响，该底物水解后受336 nm激发光激发后，在490 nm波长处的发射荧光显著增强，反应快速灵敏。Go等利用邻苯二甲醛（OPA）与游离氨基酸结合产生荧光的特点，在胶原蛋白酶与底物反应后的反应液中加入质量浓度1 mg/mL OPA（0.1 mol/L PBS，pH 7.4），被360 nm激发光激发后，检测460 nm波长处的荧光强度。此类方法快捷灵敏，能在较短的时间内获得大量数据，但荧光试剂通常较为昂贵，检测成本较高。
4、胶原蛋白酶生产现状
发酵生产
目前商业化的胶原蛋白酶主要来自溶组织梭状芽孢杆菌，通过培养溶组织梭状芽孢杆菌再从其培养上清液中分离纯化所需的胶原蛋白酶。该方法的优势在于溶组织梭状芽孢杆菌将胶原蛋白酶分泌到培养基中，可以在简单的液体培养基中大量培养，获得胶原蛋白酶的效率较高。但该方法所得的胶原蛋白酶粗制剂中还含有棕色色素、梭菌蛋白酶、氨基肽酶和几种中性蛋白酶。梭菌蛋白酶的存在导致粗酶制剂会对成骨细胞和胰岛细胞产生细胞毒性，也会导致纯化后期和贮存运输过程中胶原蛋白酶的降解。上清液中其他酶类以及多种C末端截短的胶原蛋白酶的存在增加了胶原蛋白酶分离纯化时工艺的难度，且容易造成不同批次的胶原蛋白酶粗制剂活性差异较大。目前，研究人员主要从优化溶组织梭状芽孢杆菌的培养基和改进纯化方式两大方面着手提高胶原蛋白酶的纯度。
异源表达
为获取较高纯度的胶原蛋白酶，以便进一步对胶原蛋白酶的生化性质、酶结构、催化机理、构效关系展开研究，同时拓展其在生物技术和医学等领域应用，研究人员尝试通过基因工程的手段重组表达生产胶原蛋白酶。目前相关研究已经在不同的表达体系中开展，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和产气荚膜梭菌等。
5、胶原蛋白酶的实际应用
生物医药
胶原蛋白是细胞外基质和结缔组织中的主要结构蛋白，其异常的合成和积累常常会导致纤维化相关疾病，因此，在生物医药领域常采用注射胶原蛋白酶的手段治疗相关疾病，如腰椎间盘突出、掌筋膜挛缩和佩罗尼病等。掌筋膜挛缩是掌腱筋膜中胶原蛋白的沉积导致掌指关节发生挛缩，使手指的正常功能受损的疾病，多发于中老年男性。2010年2月美国食品药品监督管理局（FDA）批准了溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶用于掌筋膜挛缩的非手术疗法。胶原蛋白酶注射疗法与掌筋膜切断术等手术疗法相比具有副作用更少、作用温和、患者满意度高等优势。
食品加工
在食品工业中，使用酶来辅助食品加工是常见的方法，它可以提高食品的营养和功能特性。在胶原蛋白酶的作用下，胶原蛋白被水解成胶原蛋白肽。研究表明摄入胶原蛋白肽可能有助于机体合成胶原蛋白，具有多种健康益处，如改善皮肤健康、减缓关节疼痛和预防骨质疏松等。Yang Xinghao等利用胶原蛋白酶水解鱼骨、鱼皮、鱼鳞等海产品副产物，发现水解物具有较高的抗氧化活性。Song Yihang等利用重组胶原蛋白酶水解牛骨胶原蛋白，通过响应面法优化水解条件，使用质量浓度110 μg/mL的胶原蛋白酶在35 ℃、pH 8条件下制得可溶性胶原蛋白肽，并从中鉴定出5 种新型抗氧化肽。
结 语
溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶可高效水解胶原蛋白，在生物医药、食品加工等行业得到了广泛应用，是最具代表性的微生物源胶原蛋白酶。目前，对溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶的组成和结构已有了较为清晰的认识，同时该酶也在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和产气荚膜梭菌中实现了异源表达，但是仍然有以下问题有待解决。
在分泌机制方面，胶原蛋白酶在溶组织梭状芽孢杆菌中的具体分泌机制未知，前导肽的具体功能作用及ColG和ColH分子截短形式的产生机理有待研究。在酶产量方面，针对纯化标签对胶原蛋白酶活力的影响以及蛋白产量低等问题，可通过选择不同的表达体系（如尝试真核表达体系：酿酒酵母或毕赤酵母等），并对异源表达体系进行代谢途径改造来进一步提高生产效率。在实际应用方面，为提高胶原蛋白酶的稳定性和生物利用度，还可通过包埋法、吸附法和共价结合法等对胶原蛋白酶进行固定化。在酶学性质拓展方面，可利用计算机辅助设计进行酶工程化改造提高酶活力、稳定性和底物特异性等。此外，由于胶原蛋白酶为模块化酶，可对不同胶原蛋白酶的优势模块进行交换，获取更具有优势的胶原蛋白酶。
本文《溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶的研究进展》来源于《食品科学》2022年43卷17期316-325页，作者：肖寒，刘秀妨，郑淋，赵谋明，黄明涛。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210830-385。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
