β-榄香烯是从我国传统中药姜科植物温郁金（温莪术）中分离提取的倍半萜类天然产物，已被证明对多种肿瘤有效，为国家二类抗肿瘤药物，其市场规模超过 40 亿人民币。
目前 β-榄香烯的生产方式主要是植物提取，具有培养周期长、受环境影响大、难以纯化等诸多问题，难以实现稳定的供应。而通过微生物细胞工厂生产 β-榄香烯离工业应用还有很大距离。
近日，大连化物所周雍进团队以多形汉逊酵母（Ogataea polymorpha）为宿主，通过优化甲羟戊酸途径、增加 NADPH 和乙酰CoA 的供应以及下调竞争途径实现了 β-榄香烯的高水平生产。工程菌株在分批发酵和补料分批发酵下分别产生 509 mg/L 和 4.7 g/L 的 β-榄香烯。相关文章以题“Global metabolic rewiring of the nonconventional yeast Ogataea polymorpha for biosynthesis of the sesquiterpenoid β-elemene”发表于 metabolic Engineering。博士研究生叶敏为本文第一作者，周雍进研究员为通讯作者。
多形汉逊酵母是一种用于蛋白质表达的非模式工业酵母，具有许多优点，例如耐热性、底物谱广和发酵密度高。研究人员表示，这项工作证明了多形汉逊酵母作为底盘细胞生产倍半萜类和其他乙酰 CoA 衍生化学品的潜力。
（来源：metabolic Engineering）
综合来看，研究团队通过系统地优化甲羟戊酸途径（MVA 途径），以及加强辅因子 NADPH 和前体乙酰 CoA 的供应，探索了多形汉逊酵母生产 β-榄香烯的潜力。这也是工程化多形汉逊酵母来生产倍半萜类化合物的首次尝试。
▲图丨在非模式酵母多形汉逊酵母中生产 β-榄香烯的路径工程示意图（来源：metabolic Engineering）
第一部分，优化 MVA 途径。
酵母本身存在 MVA 途径，该途径的产物可以看作是活化的异戊二烯单位，是类固醇、类萜等生物分子的合成前体。
Germacrene A 是 β-榄香烯的前体，可以通过体外一步化学反应转化为 β-榄香烯。Germacrene A 由 Germacrene A 合成酶催化法尼基焦磷酸 (FPP) 环化而来，FPP 是通过 MVA 途径合成的，所以应优化 MVA 途径以提高 β-榄香烯的产量。
为了找到最合适的 Germacrene A 合成酶，研究人员对已被报道的几种 Germacrene A 合成酶进行比较，结果表明，LsLTC2 在 β-榄香烯生产方面表现最好。
▲图丨通过调节 MVA途径加强 β-榄香烯的生产（来源：metabolic Engineering）
根据前人的研究，倍半萜合酶与 Erg20 的融合形成了将 FPP 转化为倍半萜的直接通道，同时最大限度地减少 FPP 的竞争性消耗。
于是，团队通过连接子 GGGGS 构建了两者的融合体，由此所得的融合体 β-榄香烯滴度比通过单独的基因表达得到的要高得多。
然后，为了系统地优化 MVA 途径，研究人员仔细评估了该途径上的每个基因，试图加强 MVA 途径的每个步骤。
首先，团队将 MVA 途径中的限速基因 转变为其在细胞质中更稳定的截断形式 tHMGR，并利用强组成型启动子控制其过量表达，令人惊讶的是，此时仅观察到 转变为其在细胞质中更稳定的截断形式 tHMGR，并利用强组成型启动子控制其过量表达，令人惊讶的是，此时仅观察到轻微的产量增加。
其次，ERG10 和 ERG13 被过量表达以驱动更多的碳通量进入 MVA 途径，结果使 β-榄香烯的滴度增加了 35%，这也表明上游 HMG-CoA 供应是多形汉逊酵母生物合成类异戊二烯（β-榄香烯的合成单元）的瓶颈。
团队还发现，参与 IPP 和 DMAPP 之间异构化的基因 IDI1 的过量表达，明显增强了 β-榄香烯的含量。这表明 IPP 和 DMAPP 之间的平衡对倍半萜的生产至关重要。
第二部分，加强 NADPH 和乙酰 CoA 的供应。
异戊二烯的生物合成需要足够数量的辅助因子 NADPH 作为驱动力；乙酰 CoA 作为倍半萜类化合物的关键组成部分，它的供应对于高效生产至关重要。
团队通过加强磷酸戊糖途径（PPP）来增加 NADPH 库；通过引入 PK (phosphoketolase)和 PTA (phosphotransacetylase)两种酶来重新连接 PPP 通量并合成更多的乙酰 CoA。
并且通过 PK 和 PTA 的融合表达以及删除特定基因避免了类似于酿酒酵母中的乙酸盐的积累（乙酸盐是乙酰辅酶 A 生产的前体）。与亲本菌株相比，PK 和 PTA 的融合表达略微增加了 β-榄香烯的产量，而 GPP1 的删除在前者的基础上进一步提高了 β-榄香烯的产量 11.4%。
▲图丨增强 NADPH 和乙酰 CoA 对 β-榄香烯生产的供应（来源：metabolic Engineering）
第三部分，下调 ERG9 表达，调控转录因子。
在增加主要途径的代谢通量的同时，研究人员还通过降低竞争途径来减少 FPP 的消耗。
其中，ERG9 将 FPP 转化为角鲨烯用于甾醇的合成，然而，这一路径不能被完全阻断，因为角鲨烯是细胞膜的一个重要组成部分。
研究人员设想通过促进 Erg9 的降解来下调角鲨烯的合成。
他们先尝试将已在酿酒酵母中验证的可有效降低麦角甾醇或角鲨烯含量的方法套用至本研究的酵母宿主中，试图通过启动子进行 ERG9 的动态控制，但这些启动子的效果都不理想。
然后，团队尝试在翻译水平上探索降解肽 CLN2PEST 下调 Erg9 。首先从酿酒酵母中克隆 CLN2PEST 基因，该基因与 Erg9 融合显著提高了 β-榄香烯的产量。
▲图丨ERG9 下调调控 β-榄香烯的产生和 UPC2-1 的表达（来源：metabolic Engineering）
最后，通过在摇瓶中进行分批补料发酵，以及优化发酵条件，最大限度地提高 β-榄香烯产量，最终实现工程菌株在分批发酵和补料分批发酵下分别产生 509 mg/L 和 4.7 g/L 的 β-榄香烯。
近年来，将非常规微生物作为细胞工厂的工程受到广泛关注。在这项研究中，通过代谢重构使这种非常规的酵母以葡萄糖为原料，高水平地生产倍半萜类化合物 β-榄香烯，在最小的培养基中获得最高的滴度。
文章指出，在研究过程中，研究人员发现了诸多多形汉逊酵母和酿酒酵母在 MVA 工程上的这些差异，这表明多形酵母存在独特的调控机制。
具体来说，许多能够有效改善酿酒酵母和解脂耶氏酵母中乙酰 CoA 衍生化学品的生产的策略，对提高多形汉逊酵母的 β-榄香烯的产量贡献不大。
作者表示，这项研究开发的用于改善辅因子和乙酰 CoA 供应的策略也可以用于其他非传统酵母中其他乙酰 CoA 衍生化学品的生产。
此前，周雍进团队还以多形汉逊酵母为生产宿主，通过适应性进化与理性代谢工程改造相结合的方式，并借助多组学测序分析，实现了甲醇生物转化高效合成脂肪酸，产量达 15.9 g/L。
前不久，周雍进团队还实现了以葡萄糖为原料高效合成香紫苏醇，产量达到 11.4 g/L。据悉，这一产量是目前已有报道中二萜类化合物的最高产量。
