portant; overflow-wrap: break-word !important;">维生素D3是人体必需的脂溶性维生素，在人体生长、发育和维持健康方面发挥重要作用。维生素D3可以作为保健药物、膳食补充剂和营养强化剂，拥有巨大的市场。作为合成维生素D3的重要前体，7-脱氢胆固醇（7-Dehydrocholesterol，7-DHC）的合成受到广泛关注。目前工业生产7-DHC主要采用化学合成法，以羊毛脂为原料，经酯化、氧化、还原和水解等多步反应合成。在整个合成过程中，需要严苛的反应条件并加入大量有机试剂，不仅会对环境造成污染，而且伴随着各种副产物的生成。相比而言，微生物合成法因其副产物少、环保、可持续等特点而更具吸引力。目前虽有利用酵母合成7-DHC的报道，但由于7-DHC合成路径较长，采用传统的基因敲除和过表达策略难以实现7-DHC的高效合成。
portant; overflow-wrap: break-word !important;">针对以上问题，该研究选择酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为出发菌株，通过重构甾醇代谢模块最终实现了7-DHC的高效合成。首先，将7-DHC合成路径分为4个模块：中心代谢模块、甲羟戊酸模块、角鲨烯模块和7-DHC模块。使用PGAL启动子过表达四个模块中的6个基因（tHMG1、IDI1、ERG1、ERG11、ADH2和ERG7），并选择PTEF1启动子过表达调控甾醇代谢的转录因子突变体UPC2G888A，菌株7-DHC产量从1.2 mg/L增加到115.3 mg/L（图1）。其次，构建了CRISPR/dCpf1介导的转录激活系统和CRISPR/dCas9介导的转录抑制系统，前者进一步激活使用PGAL启动子驱动的关键基因的表达（图2），后者抑制7-DHC合成过程中分支路径的关键基因（ERG6、MLS1和CIT2）的表达，菌株7-DHC的产量提升至312.4 mg/L（图3）。
portant; overflow-wrap: break-word !important;">参与合成7-DHC的酶分布于不同的亚细胞结构中，这可能不利于中间代谢物的传递，进而影响7-DHC的合成。为了避免上述问题，该研究将角鲨烯和7-DHC模块中的6个基因（ERG7、ERG20、IDI1、MVD1、ERG8和ERG12）依次重定位于内质网中，通过内质网区室化进一步重构甾醇代谢路径。在此基础上，过表达INO2增加内质网表面积（图4），摇瓶发酵结果显示，7-DHC的产量显著增加，达到455.6 mg/L。在5 L发酵罐上，通过补料分批发酵，获得2870 mg/L的7-DHC，是迄今为止报道的最高产量（图5）。
portant; overflow-wrap: break-word !important;">上述研究工作得到了国家重点研发项目(2018YFA0900300)、国家自然科学基金(31930085, 32021005)、中央高校基本科研专项资金(JUSRP121010, JUSRP221013, JUSRP52019A)等项目的资助。
图1 模块化改造酿酒酵母提升7-DHC产量
图2 CRISPR/dCpf1激活系统的构建与应用
图3 CRISPR/dCas9抑制系统的构建与应用
图4 甾醇代谢路径的重构
图5 5 L发酵罐中补料分批发酵
