江南大学周景文等改造大肠杆菌转化3-氰基吡啶高产烟酰胺核苷（NR）

 

一种产烟酰胺核糖苷的重组菌

 

1.本发明涉及一种产烟酰胺核糖苷的重组菌，属于基因工程及生物工程技术领域。

 

 

背景技术：

 

2.烟酰胺核糖苷(nicotinamide riboside，nr)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad

+

)的重要前体物质之一。研究表明外源补充nr可以有效的供给和提高胞内的nadh水平。而nadh已证明具有诸多生物学功能，如抗衰老，抗疾病、抗氧化等，nr的生物功能也得到验证，外源补充nr可以明显提高小鼠的耐寒性、提高线粒体的丰度，进而适当的延长了寿命。

3.随着nr的重要生物学功能得到验证，基于nr的合成研究越来越多。但是目前主要集中利用化学合成的方式。在公开号为cn110452277a的中国发明申请专利中，发明人以烟酰胺和1,2,3,5-四乙酰-β-d-呋喃核糖为底物，经过缩合反应、乙酰基脱保护反应、柱层析、蒸馏干燥、重结晶，得到成品nr。在公开号为cn111763235a的中国发明申请专利中，发明人以呋喃核糖、烟酸甲酯、和氯仿，加入三氟甲磺酸三甲硅脂作为催化剂，合成nr。利用化学合成转化效率相对较高，但是催化剂和有毒试剂的加入限制了生成的nr在食品领域的应用。

 

 

技术实现要素：

 

4.为解决上述问题，本技术旨在寻找提高烟酰胺核糖苷产量的生物转化法，利用成本低的烟酰胺作为底物，经过全细胞催化的方式高效的转化生产烟酰胺核糖苷。

5.本发明的第一个目的是提供一株可利用烟酰胺合成烟酰胺核糖苷的重组菌株，所述菌株是在出发菌株的基础上，过表达5'-核苷酸酶基因usha，并敲除嘌呤核苷磷酸酶基因deod、烟酰胺核糖苷转运体基因pnuc、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因riha、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb和核糖核苷水解酶rihc。

6.在一种实施方式中，所述出发菌株为大肠杆菌。

7.在一种实施方式中，所述出发菌株敲除了烟酰胺单核苷酸氨基水解酶基因pncc、dna结合转录抑制因子/烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶基因nadr、dna结合转录抑制因子基因purr和5'-核苷酸酶基因usha中的至少一个基因。

8.在一种实施方式中，所述出发菌株为大肠杆菌f004(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr)，已公开于公开号为cn112795582a的专利申请文件中。

9.在一种实施方式中，deod基因如gene id:945654所示、pnuc基因如gene id:945350所示、riha基因如gene id:945503所示、rihb基因如gene id:946646所示和rihc基因如gene id:944796所示；usha基因如seq id no.4所示。

10.在一种实施方式中，以pet-28a(+)或prsfduet为载体，表达baprs基因和vpnadv基因。

11.在一种实施方式中，以pacycduet-1或pcdfduet为载体，表达usha基因。

12.在一种实施方式中，以pacycduet-1或pcdfduet为载体，表达usha基因和bmpnuc基

因。

13.在一种实施方式中，利用crispr-cas9基因编辑系统敲除重组大肠杆菌f004的deod基因，获得重组菌株f005(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod)。

14.在一种实施方式中，利用crispr-cas9基因编辑系统敲除重组大肠杆菌f005的pnuc基因，获得重组菌株f007(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc)。

15.在一种实施方式中，利用crispr-cas9基因编辑系统敲除重组大肠杆菌f007的riha基因，获得重组菌株f008(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、deod、δpnuc、δriha)。

16.在一种实施方式中，利用crispr-cas9基因编辑系统敲除重组大肠杆菌f008的rihb基因，获得重组菌株f009(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、deod、δpnuc、δriha、δrihb)。

17.在一种实施方式中，利用crispr-cas9基因编辑系统敲除重组大肠杆菌f009的rihc基因，获得重组菌株f010(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、deod、δpnuc、δriha、δrihb、δrihc)。

18.本发明还提供一种促进重组大肠杆菌合成nr的方法，是在大肠杆菌中过表达如seq id no.1所示的烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因vpnadv、seq id no.2所示的prpp合酶基因baprs和seq id no.3所示的烟酰胺单核苷酸转运体基因bmpnuc，并敲除pncc基因、usha基因、nadr基因和purr基因、deod基因、pnuc基因、riha基因、rihb基因、rihc基因。

19.本发明还提供一种以烟酰胺为底物生产烟酰胺核糖苷的方法，是将所述重组菌株在35～37℃培养一段时间后，并用iptg诱导生产烟酰胺核糖苷，在加入诱导剂的同时加入底物烟酰胺。

20.在一种实施方式中，所述诱导是在25～37℃下进行。

21.在一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌在发酵培养基中，于35～37℃培养至od

600

＝0.6～1.0，再降温至24～26℃，加入终浓度0.2mm～1mm iptg，并添加100mg～10g/l的烟酰胺。

22.在一种实施方式中，所述发酵培养基含有kh2po

4 6～12g/l、k2hpo

4 16～30g/l、硫酸铵5～10g/l、一水柠檬酸1g/l～5g/l、mgso4.7h2o 1～5g/l、酵母粉10～30g/l、葡萄糖15～50g/l。

23.在一种实施方式中，所述发酵培养基含有kh2po

4 3g/l、k2hpo

4 7.33g/l、柠檬酸0.85g/l、硫酸铵15g/l、金属离子溶液5ml、葡萄糖20g/l、mgso4.7h2o 1g/l、酵母粉5g/l。

24.在一种实施方式中，在加入诱导剂后，将所述烟酰胺一次性或分批次加入至培养基中。

25.在一种实施方式中，所述分批次是分两次加入，每两小时加入一次烟酰胺；或分四次加入，每一小时加入一次烟酰胺。

26.在一种实施方式中，将所述重组菌株在lb培养基中培养获得种子培养液，再将种子培养液按照1％～5％转接量转接至tb培养基中。

27.本发明还提供所述的重组大肠杆菌在食品、药品、化妆品、饲料、纺织品领域制备

含烟酰胺核糖苷的产品中的应用。

28.有益效果：本发明基于已有的nad衍生物生产菌株，基于crispr-cas9技术将大肠杆菌内源存在的对nad衍生物具有分解作用的酶基因敲除，消除nr的降解途径和转运蛋白，获得利于nr积累的改造菌株，并通过过表达菌体内源酶(usha)，提高nr的合成能力。使菌株在摇瓶水平上可利用1g/l烟酰胺合成2g/l nr，转化率为90％以上；在5l发酵罐水平，底物浓度为15g/l烟酰胺可以获得20g/l以上nr，底物剩余1g/l，转化率在70％以上，具有工业化应用潜力。

附图说明

29.图1为具有催化nad衍生物向nr转变的功能酶的鉴定。

30.图2为重组大肠杆菌、对照以及标品的lc-ms图。

31.图3为不同诱导温度下nr的合成效果。

32.图4为不同iptg浓度下nr的合成效果。

33.图5为不同底物烟酰胺添加浓度下nr的合成效果。

34.图6为不同重组菌株nr的合成效果。

35.图7为消除nad

+

衍生物转运蛋白后对生产nr的效果。

36.图8为采用分批补料的方式在5l发酵罐水平生产nr的效果。

37.图9为采用流加补料的方式在5l发酵罐水平生产nr的效果。

具体实施方式

38.(一)培养基

39.lb培养基：酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l。加入15g/l琼脂条，以配制lb固体培养基。

40.tb培养基：酵母浸粉24g/l，蛋白胨12g/l，甘油5g/l、k2hpo

4 12.54g/l、kh2po

4 2.31g/l。

41.发酵培养基1：kh2po

4 6g/l～12g/l、k2hpo

4 16g/l～30g/l、硫酸铵5g/l～10g/l、一水柠檬酸1g/l～5g/l、mgso4.7h2o 1g/l～5g/l、酵母粉10g/l～30g/l、葡萄糖15g/l～50g/l。

42.发酵培养基2：kh2po

4 3g/l、k2hpo

4 7.33g/l、柠檬酸0.85g/l、硫酸铵15g/l、金属离子溶液5ml、葡萄糖20g/l、mgso4.7h2o 1g/l、酵母粉5g/l、消泡剂0.01％。

43.补料培养基：葡萄糖700g/l、硫酸铵73g/l、mgso4.7h2o 9g/l、酵母粉5g/l、金属离子溶液15ml、浓盐酸1ml。

44.(二)溶液

45.200g/l的烟酰胺溶液：10g烟酰胺溶于50ml的超纯水，并且过滤除菌。

46.金属离子溶液：10g/l feso4·

7h2o，1.53g/l cacl2，2.2g/l znso4·

7h2o，mnso4

·

4h2o，1g/l cuso4·

5h2o，0.1g/l(nh4)6mo7o

24

·

4h2o，0.2g/l na2b4o7·

10h2o，1g/l nicl2，1g/l h3bo3，10ml/l hcl用于配制发酵培养基2及补料培养基。

47.(三)烟酰胺、nad衍生物及nr的hplc检测：利用色谱柱(250×4.6mm,5μm,thermo-fisher,ma,usa)，在30℃检测条件用日本岛津的spd-20a检测器，流动相为20mm乙酸铵，含

有5％的乙腈；流速：1.0ml/min；检测波长：259nm；柱温箱温度：30℃。

48.(四)转化率的计算：烟酰胺的相对分子质量：122；烟酰胺核糖苷(nr)的相对分子质量：256。摩尔转化率(％)＝(烟酰胺浓度÷122)/(nr/256)×100％

49.(五)大肠杆菌化学转化法：将大肠杆菌jm109划线于固体lb平板上，37℃培养12h，挑选单菌落接种于液体lb培养基中，37℃，220r/min生长10h，按照1％的接种量转接至新鲜的25ml液体lb培养基中，37℃培养1.5h～2h，待od

600长至0.6～1，收菌制作感受态细胞。

50.大肠杆菌感受态的制作使用takara的competent cell preparation kit感受态制作试剂盒，具体操作流程参照使用说明。制作好的感受态细胞保存在-80℃条件，后续可以转化质粒或者片段等。

51.(六)质粒组装方法：gibson反应体系如下，dna片段加入50ng，载体加入100ng，gibson mix加入5μl，加入无菌超纯水至体系10μl。反应条件如下，50℃反应60min，反应结束后立即置于冰上。取10μl转化至大肠杆菌感受态jm109。

52.无缝克隆反应体系如下，目的基因40ng，载体加入100ng，反应酶混合液5μl,加入无菌超纯水补齐至10μl。反应条件如下，50℃反应60min，反应结束后立即置于冰上。取10μl转化至大肠杆菌感受态jm109。

53.(七)菌株

54.重组大肠杆菌f004(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr)公开于公开号为cn112795582a的专利申请文件中。

55.实施例1：烟酰胺核糖苷合成途径相关基因表达载体的构建

56.(1)vpnadv表达框的构建

57.以vpnadv合成序列(seq id no.1所示)为模板，以引物对f1/r1通过pcr扩增vpnadv片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行扩增。将pcr产物进行产物纯化；以载体pet-28a(+)为模板，以引物对f2/r2 pcr扩增载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行扩增。将pcr产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将扩增得到的片段vpnadv和pet-28a(+)载体片段重组为载体pet28a+vpnadv，并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pet28a+vpnadv。

58.(2)nad+衍生物合成表达框的构建

59.以baprs合成序列(seq id no.2所示)为模板，以引物对f3/r3通过pcr扩增baprs片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行扩增。将pcr产物进行产物纯化；以步骤(1)获得的重组质粒pet28a+vpnadv为模板，以引物对f4/r4进行pcr扩增pet28a+vpnadv载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行扩增。将pcr产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将baprs片段和pet28a+vpnadv载体片段重组为载体pet28a+baprs+vpnadv。并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pet28a+baprs+vpnadv。

60.(3)nad+衍生物转运载体表达框的构建

61.以bmpnuc合成序列(seq id no.3所示)为模板，以引物对f5/r5通过pcr扩增bmpnuc片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行扩增。获得基因baprs片段，将pcr产物进行产物纯化；以载体pacycduet-1为模板，以引物对f6/r6进行pcr扩增pacycduet载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行扩增。将pcr产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将bmpnuc片段和pacycduet载体片段重组为载体pacycduet+bmpnuc。并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pacycduet+bmpnuc。

62.(4)烟酰胺核糖苷(nr)合成表达框的构建

63.以大肠杆菌k-12基因组为模板，以引物对f7/r7进行pcr扩增usha基因片段(seq id no.4所示)，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行扩增，将pcr产物进行产物纯化。以步骤(3)构建的重组质粒pacycduet+bmpnuc为模板，以引物对f8/r8进行pcr扩增pacycduet+bmpnuc载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行扩增。将pcr产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将片段usha基因片段和载体pacycduet+bmpnuc载体片段重组为载体pacycduet+usha+bmpnuc。并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pacycduet+usha+bmpnuc。

64.表1引物信息

65.[0066][0067]

实施例2：利用nad衍生物转运蛋白获得高浓度nad+衍生物

[0068]

在菌株f004(e.coliδpncc、δnadr、δpurr、δusha，公开于公开号为cn112795582a的专利申请文件中)中表达实施例1构建的nad+

衍生物合成重组质粒pet28a+baprs+vpnadv(公开于公开号为cn112795582a的专利申请文件中)，获得重组菌株nm001。将实施例1构建的pacycduet+bmpnuc转化至菌株nm001，获得表达转运蛋白bmpnuc的重组菌nm002。首先从-80℃划线于含有抗性的lb固体平板上，37℃过夜培养，挑选单菌落接种于相应抗性的lb培养基中，37℃、220r/min培养8h～10h，按照1％转接量接入发酵培养基1中，待od600

达到0.6～1时降温至25℃，并加入终浓度0.5mm iptg诱导蛋白表达。结果显示，摇瓶水平在发酵培养基1中添加终浓度1g/l烟酰胺可以合成2.6g/l以上nad衍生物。在5l发酵罐水平上向发酵培养基1中加入10g/l烟酰胺合成20g/l以上烟酰胺单核苷酸(nmn)，底物剩余3g/l以上，转化率60％以上。

[0069]

实施例3：催化烟酰胺核糖苷合成的基因的确定

[0070]

为筛选更优的5'-核苷酸酶催化nad衍生物脱磷酸生成烟酰胺核糖苷(nr)，分别选取来源不同(包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌)的5'-核苷酸酶基因，连接在表达载体pet-28a(+)上单独表达。

[0071]

(1)usha表达框的构建

[0072]

以大肠杆菌k-12基因组为模板，以引物对f9/r9进行pcr扩增usha片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化；以载体pet-28a(+)为模板，以引物对f10/r10进行pcr扩增pet-28a(+)载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将usha片段和pet-28a(+)载体片段重组为载体pet28a+usha。并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pet28a+usha。

[0073]

(2)sure表达框的构建

[0074]

以大肠杆菌k-12基因组为模板，以引物对f11/r11进行pcr扩增sure片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化；以载体pet-28a(+)为模板，以引物对f12/r12进行pcr扩增pet-28a(+)载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将sure片段和pet-28a(+)载体片段重组为载体pet28a+sure。

并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pet28a+sure。

[0075]

(3)yfrg表达框的构建

[0076]

以大肠杆菌k-12基因组为模板，以引物对f13/r13进行pcr扩增yfrg片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化；以载体pet-28a(+)为模板，以引物对f14/r14进行pcr扩增pet-28a(+)载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将yfrg片段和pet-28a(+)载体片段重组为载体pet28a+yfrg。并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pet28a+yfrg。

[0077]

(4)yjjg表达框的构建

[0078]

以大肠杆菌k-12基因组为模板，以引物对f15/r15进行pcr扩增yjjg片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化；以载体pet-28a(+)为模板，以引物对f16/r16进行pcr扩增pet-28a(+)载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将yjjg片段和pet-28a(+)载体片段重组为载体pet28a+yjjg。并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pet28a+yjjg。

[0079]

(5)cg0034表达框的构建

[0080]

以谷氨酸棒状杆菌atcc13032基因组为模板，以引物对f16/r16进行pcr扩增cg0034基因片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化；以载体pet-28a(+)为模板，以引物对f17/r17进行pcr扩增pet-28a(+)载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将cg0034片段和pet-28a(+)载体片段重组为载体pet28a+cg0034。并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pet28a+cg0034。

[0081]

(6)cg00397表达框的构建

[0082]

以谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组为模板，以引物对f18/r18进行pcr扩增cg00394片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将pcr产物进行产物纯化；以载体pet-28a(+)为模板，以引物对f19/r19进行pcr扩增pet-28a(+)载体片段，选择phanta mastermix(vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min。将pcr

产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将cg00394片段和pet-28a(+)载体片段重组为载体pet28a+cg00397。并转化大肠杆菌jm109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pet28a+cg00397。

[0083]

将上述构建的重组质粒pet28a+usha、pet28a+sure、pet28a+yfrg、pet28a+yjjg、pet28a+cg0034和pet28a+cg00397分别转入重组大肠杆菌f004中，分别获得nr001、nr002、nr003、nr004、nr005、nr006。为验证酶基因的功能，首先从-80℃划线于含有抗性的lb固体平板上，37℃过夜培养，挑选单菌落接种于相应抗性的lb培养基中，37℃、220r/min培养8～10h，按照1％转接量接入发酵培养基1中，待od

600

＝0.6～1时降温至25℃，并加入终浓度0.5mm iptg诱导蛋白表达。12h后收集菌体细胞，用ph＝7.0的pbs缓冲液清洗细胞2次，均质机破碎菌体细胞，向用细胞破碎液加入终浓度1g/l的nad衍生物，同时加入终浓度1g/l的mg

2+

，2h取样hplc检测nad衍生物变化情况，从图1中可以看出只有重组菌株nr001可以降解nad衍生物且催化活性较高，说明来源大肠杆菌的usha具有合成nr的潜力。

[0084]

表2引物信息

[0085]

引物序列5

’‑3’f9aactttaagaaggagatataccatgaaattattgcagcggggcgr9ttcgggctttgttactgccagctcacctcacctf10gctggcagtaacaaagcccgaaaggaagctgagr10ctgcaataatttcatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttct
agagggf11taagaaggagatataccatgcgcatattgctgagtaatgatgacr11ctttcgggctttgttaccattgcgtgccaactcccf12cgcaatggtaacaaagcccgaaaggaagctgagr12cagcaatatgcgcatggtatatctccttcttaaagttaaa
caaaattatttctagagggf13actttaagaaggagatataccatgcatatcaacattgcctggcagr13ctttcgggctttgtcacattagcgaggggatcaggf14ctcgctaatgtgacaaagcccgaaaggaagctgagtr14caatgttgatatgcatggtatatc
tccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggf15aaggagatataccatgaagtgggactggattttctttgatgcr15tcgggctttgtcagtgtttacacaggagctgctccf16ctgtgtaaacactgacaaagcccgaaaggaagctgagtr16ccagtcccact
tcatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagagggf17gaaggagatataccatgaagaggctttcccgtgcr17tcctttcgggctttgttacatgaactgcgcaaacatagcctgf18cagttcatgtaacaaagcccgaaaggaagctgagr18gg
gaaagcctcttcatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggf19caaatctttgcttaacaaagcccgaaaggaagctgagr19agtttccagactgcatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagagg

[0086]

实施例4：构建利于烟酰胺核糖苷生物合成的菌株

[0087]

(1)敲除分解基因deod

[0088]

利用crispr-cas9基因编辑系统对参与nr分解的相关酶基因deod进行敲除，将含

有cas9蛋白的质粒pcas9通过化学转化法转入菌株f004(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr)感受态中，涂板于含有kana抗性的平板上，30℃过夜培养20h；挑选单菌落接种于含有kana的液体lb中，30℃，220r/min培养12h；按体积计1％～5％接种量转接至新鲜的lb中，并加入10g/l～50g/l阿拉伯糖；30℃培养1.5h～2h，至od600

＝0.2时，再加入10g/l～50g/l阿拉伯糖；继续培养至od

600

＝0.6～1，收菌制作电转感受态。电转感受态细胞需要用10％的无菌甘油清洗两次，再用10％甘油重悬，-80℃保存。

[0089]

用t-deod-1-f和t-deod-1-r扩增获得同源片段t-deod的上游片段t-deod-up，用t-deod-2-f和t-deod-2-r扩增获得同源片段t-deod的下游片段t-deod-dn，通过融合pcr将上游片段t-deod-up和下游片段t-deod-dn融合获得同源片段t-deod。用deod-sgrna-1-f和deod-sgrna-1-r扩增获得deod-sgrna的线性化片段，转化入e.coli jm109菌中，提取质粒获得deod-sgrna。将同源片段t-deod和deod-sgrna加入至菌株f004(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr)感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。混合液再加入到1mm电转杯(至于冰上预冷)中，1.8kv电击5ms，加入1ml预冷lb液体培养基。30℃，220r/min摇床复苏1～2h后，涂布添加相应抗生素的lb平板，30℃培养24h。使用通用引物sgrna-f(ctgtccttctagtgtagccgtag)与deod特异引物yan-pncc-sgrna-r(cgttgttcacttcaactagtattatacctaggac)进行菌落pcr验证，筛选阳性转化子，得到菌株f005(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod)。

[0090]

将获得的菌株f005(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod)胞内所包含的crispr-cas9系统使用的质粒消除，具体步骤为：将菌株f005(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod)接种于含有相应抗性的液体lb，加入终浓度0.5mm～1mm的iptg，诱导cas9蛋白将质粒deod-sgrna切割，验证deod-sgrna质粒消除完成后，继续将pcas9质粒去除，接种于无抗的液体lb培养基中，42℃，培养6～10h。验证pcas9质粒消除后，菌株-80℃保藏。

[0091]

(2)敲除转运蛋白pnuc

[0092]

利用crispr-cas9基因编辑系统对转运蛋白pnuc基因进行敲除，将含有cas9蛋白的质粒pcas9通过化学转化法转入步骤(1)构建的菌株f005(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod)感受态中，涂板于含有kana抗性的平板上，30℃过夜培养20h；挑选单菌落接种于含有kana的液体lb中，30℃，220r/min培养12h；按体积计1％～5％接种量转接至新鲜的lb中，同时加入10g/l～50g/l阿拉伯糖；30℃培养1.5～2h，待od

600＝0.2时，再加入10g/l～50g/l阿拉伯糖；继续培养至od600

＝0.6～1，收集菌体并制作电转感受态。电转感受态细胞需要用10％的无菌甘油清洗两次，再用10％甘油重悬，-80℃保存。

[0093]

按照步骤(1)相同策略构建同源片段t-pnuc和pnuc-sgrna质粒，将同源片段t-pnuc和pnuc-sgrna质粒加入菌株f005感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。混合液再加入到1mm电转杯(至于冰上预冷)中，1.8kv电击5ms，加入1ml预冷lb液体培养基。30℃，220r/min摇床复苏1～2h后，涂布添加相应抗生素的lb平板，30℃培养24h。使用通用引物sgrna-f(ctgtccttctagtgtagccgtag)与pnuc特异引物yan-pnuc-sgrna-r(tggcaaggccaatacacactagtat)进行菌落pcr验证，筛选阳性转化子，得到菌株f007(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc)。

[0094]

将菌株f007(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δ

pnuc)胞内所包含的crispr-cas9系统使用的质粒pnuc-sgrna消除，具体步骤为：将菌株f007(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc)接种于含有相应抗性的液体lb，加入终浓度0.5mm～1mm的iptg，诱导cas9蛋白将质粒pnuc-sgrna切割，验证pnuc-sgrna质粒消除完成后，继续将pcas9质粒去除，接种于无抗的液体lb培养基中，42℃，培养6～10h。验证pcas9质粒消除后，菌株-80℃保藏。

[0095]

(3)敲除分解基因riha

[0096]

利用crispr-cas9基因编辑系统对相关酶基因进行敲除，将含有cas9蛋白的质粒pcas9通过化学转化法转入步骤(2)构建的菌株f007(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc)感受态中，涂板于含有kana抗性的平板上，30℃过夜培养20h；挑选单菌落接种于含有kana的液体lb中，30℃，220r/min培养12h；按体积计1％～5％接种量转接至新鲜的lb中，同时加入10g/l～50g/l阿拉伯糖；30℃培养1.5～2h，待od

600

＝0.2时，再加入10g/l～50g/l阿拉伯糖；继续培养至od

600

＝0.6～1，收菌制作电转感受态。电转感受态细胞需要用10％的无菌甘油清洗两次，再用10％甘油重悬，-80℃保存。

[0097]

按照步骤(1)相同策略构建同源片段t-riha和riha-sgrna质粒，将同源片段t-riha和riha-sgrna质粒加入菌株f007(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc)感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。混合液再加入到1mm电转杯(至于冰上预冷)中，1.8kv电击5ms，加入1ml预冷lb液体培养基。30℃，220r/min摇床复苏1～2h后，涂布添加相应抗生素的lb平板，30℃培养24h。使用通用引物sgrna-f(ctgtccttctagtgtagccgtag)与riha特异引物yan-riha-sgrna-r(gtcgcaatctaacagaatactagtattatacctagg)进行菌落pcr验证，筛选阳性转化子，得到菌株f008(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha)。

[0098]

将获得的菌株f008(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha)胞内所包含的crispr-cas9系统的riha-sgrna质粒消除，具体步骤为：将菌株f008(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha)接种于含有相应抗性的液体lb时，加入终浓度0.5mm～1mm的iptg，诱导cas9蛋白将质粒riha-sgrna切割，验证riha-sgrna质粒消除完成后，继续将pcas9质粒去除，接种于无抗的液体lb培养基中，42℃，培养6～10h。验证pcas9质粒消除后，菌株-80℃保藏。

[0099]

(4)敲除分解基因rihb

[0100]

利用crispr-cas9基因编辑系统对分解基因rihb进行敲除，将含有cas9蛋白的质粒pcas9通过化学转化法转入步骤(3)构建的菌株f008(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha)感受态中，涂板于含有kana抗性的平板上，30℃过夜培养20h；挑选单菌落接种于含有kana的液体lb中，30℃，220r/min培养12h；按体积计1％～5％接种量转接至新鲜的lb中，同时加入10g/l～50g/l阿拉伯糖；30℃培养1.5～2h，待od

600

长至0.2时，再加入1％～5％阿拉伯糖；继续培养至od

600

＝0.6～1，收菌制作电转感受态。电转感受态细胞需要用10％的无菌甘油清洗两次，再用10％甘油重悬，-80℃保存。

[0101]

按照步骤(1)相同策略构建同源片段t-rihb和rihb-sgrna质粒，将同源片段t-rihb和rihb-sgrna质粒加入菌株f008(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha)感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。混合液再加入到1mm电转杯(至于冰上预冷)中，1.8kv电击5ms，加入1ml预冷lb液体培养基。30℃，220r/

min摇床复苏1～2h后，涂布添加相应抗生素的lb平板，30℃培养24h。使用通用引物sgrna-f(ctgtccttctagtgtagccgtag)与riha特异引物yan-rihb-sgrna-r(gtttcgctgccatcatcactagt)进行菌落pcr验证，筛选阳性转化子，得到菌株f009(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb)。

[0102]

获得的f009(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb)改造菌株，作为后续发酵的底盘菌株，需要将胞内所包含的crispr-cas9系统使用的质粒消除掉。消除菌株内的rihb-sgrna，具体步骤为：将f009(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb)接种于含有相应抗性的液体lb时，加入终浓度0.5mm～1mm的iptg可诱导cas9蛋白将质粒rihb-sgrna切割，验证rihb-sgrna质粒消除完成后，继续将pcas9质粒去除，接种于无抗的液体lb培养基中，42℃，培养6～10h。验证pcas9质粒消除后，菌株-80℃保藏。

[0103]

(5)敲除分解基因rihc

[0104]

利用crispr-cas9基因编辑系统对分解基因rihc进行敲除，将含有cas9蛋白的质粒pcas9通过化学转化法转入步骤(4)构建的菌株f009(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb)感受态中，涂板于含有kana抗性的平板上，30℃过夜培养20h；挑选单菌落接种于含有kana的液体lb中，30℃，220r/min培养12h；按体积计1％～5％接种量转接至新鲜的lb中，同时加入10g/l～50g/l阿拉伯糖；30℃培养1.5～2h，待od

600

长至0.2时，再加入10g/l～50g/l阿拉伯糖；继续培养至od

600

＝0.6～1，收菌制作电转感受态。电转感受态细胞需要用10％的无菌甘油清洗两次，再用10％甘油重悬，-80℃保存。

[0105]

按照步骤(1)相同策略构建同源片段t-rihc和rihc-sgrna质粒，将同源片段t-rihc和rihc-sgrna质粒加入菌株f009(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb)感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。混合液再加入到1mm电转杯(至于冰上预冷)中，1.8kv电击5ms，加入1ml预冷lb液体培养基。30℃，220r/min摇床复苏1～2h后，涂布添加相应抗生素的lb平板，30℃培养24h。使用通用引物sgrna-f(ctgtccttctagtgtagccgtag)与riha特异引物yan-rihc-sgrna-r(ttgccgtgcacagatgca)进行菌落pcr验证，筛选阳性转化子，得到菌株f010(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb、δrihc)。

[0106]

将获得的菌株f010(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb、δrihc)胞内所包含的crispr-cas9系统使用的质粒rihc-sgrna消除，具体步骤为：将f010(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb、δrihc)接种于含有相应抗性的液体lb时，加入终浓度0.5mm～1mm的iptg可诱导cas9蛋白将质粒rihc-sgrna切割，验证rihc-sgrna质粒消除完成后，继续将pcas9质粒去除，接种于无抗的液体lb培养基中，42℃，培养6～10h。验证pcas9质粒消除后，菌株-80℃保藏。

[0107]

表3引物信息

[0108][0109][0110]

实施例5：烟酰胺核糖苷生物合成能力的验证

[0111]

在具有nad

+

衍生物合成能力的菌株的基础上，消除nr降解和转运路径后，强化内

源5'-核苷酸酶(usha)，并过表达nad

+

衍生物转运蛋白，有助于使合成的nad

+

衍生物转运并积累在胞外。以实施例4构建的f010 e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb、δrihc为宿主菌，将按实施例1的方法构建的nad

+

衍生物合成质粒pet28a+baprs+vpnadv、nr合成质粒pacycduet+usha+bmpnuc转化至宿主菌中，获得重组菌株nr007。

[0112]

为验证重组菌株nr007合成nr的能力，将重组菌株nr007划线于适当抗性的lb固体平板上，37℃过夜培养；挑选单菌落接种于含有相应抗性的lb培养基中，37℃，220r/min，培养10～12h；按照2％转接量转接至30ml发酵培养基1中，37℃培养至od

600

为0.6～1.0时，降温至25℃。加入终浓度为0.2～0.5mm iptg，加入1～3g/l烟酰胺，定时取样，hplc检测nr的合成情况。

[0113]

结果显示，在hplc检测中发现样品中出现与标品nr出峰时间一致的吸收峰，为进一步验证是否样品中是否有nr的合成，将样品进行lc-ms验证，如图2所示，样品中确定有nr的合成，在底物烟酰胺浓度为1g/l的情况下，诱导24h胞外积累nr达700mg/l。

[0114]

实施例6：摇瓶水平nr合成条件的优化

[0115]

为进一步提高nr合成量，提高转化率，以实施例5构建的具有合成nr能力的重组菌株nr007为例，在摇瓶水平对nr发酵过程条件进行优化，主要包含诱导温度、iptg浓度、底物添加浓度、底物添加方式。

[0116]

(1)诱导温度对nr合成的影响

[0117]

将实施例5构建的重组菌株nr007划线于适当抗性的lb固体平板上，37℃过夜培养；挑选单菌落接种于含有卡纳和链霉素抗性的lb培养基中，37℃，220r/min，培养10～12h；按照2％转接量转接至30ml发酵培养基1中，37℃培养至od

600

为0.6～1.0时，分别在不同的温度(37℃、30℃、25℃)下诱导蛋白表达。加入终浓度为0.2～0.5mm iptg，加入终浓度为1～3g/l烟酰胺，定时取样，hplc检测nr的合成情况。结果如图3所示，在底物烟酰胺浓度为1g/l时，在30℃下，诱导24h可以合成nr 844mg/l，相比较25℃和37℃分别提高了5.7％和4.2％，说明30℃更利于nr的合成。

[0118]

(2)iptg浓度对nr合成的影响

[0119]

将实施例5构建的重组菌株nr007划线于适当抗性的lb固体平板上，37℃过夜培养；挑选单菌落接种于含有卡纳和链霉素抗性的lb培养基中，37℃，220r/min，培养10～12h；按照2％转接量转接至30ml发酵培养基1中，37℃培养至od

600

为0.6～1.0时，30℃诱导蛋白表达。分别加入不同终浓度(0.2、0.5、1.0mm)iptg，并加入终浓度1～3g/l烟酰胺，定时取样，hplc检测nr的合成情况。如图4所示，在添加底物烟酰胺1g/l、诱导温度30℃的条件下，采用终浓度0.5mm iptg诱导24h，可以合成nr 863mg/l，相比iptg终浓度为0.2、1.0mm的合成能力分别提高19％和6.5％。

[0120]

(3)底物添加量对nr合成量的影响

[0121]

将实施例5构建的重组菌株nr007划线于适当抗性的lb固体平板上，37℃过夜培养；挑选单菌落接种于含有卡纳和链霉素的lb培养基中，37℃，220r/min，培养10～12h；按照2％转接量转接至30ml发酵培养基1中，37℃培养至od

600

为0.6～1.0时，30℃条件下诱导蛋白表达。加入终浓度0.5mm iptg，分别加入不同终浓度(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0g/l)烟酰胺，定时取样，hplc检测nr的合成情况。结果如图5所示，在1g/l烟酰胺浓度下菌体nr的

产量更高，可以合成nr 871mg/l，摩尔转化率可达41.3％，可能由于过高的烟酰胺的并不利于更高浓度nr的获得。

[0122]

(4)底物添加方式对nr合成量的影响

[0123]

将实施例5构建的重组菌株nr007划线于适当抗性(卡纳和链霉素)的lb固体平板上，37℃过夜培养；挑选单菌落接种于含有卡纳和链霉素抗性的lb培养基中，37℃，220rpm/min，培养10-12h；按照2％转接量转接至30ml发酵培养基1中，37℃培养至od

600

为0.6-1.0时，于30℃加入终浓度0.5mm iptg诱导蛋白表达。烟酰胺以不同的方式加入，分别为：

[0124]

组1：一次加入终浓度1g/l的烟酰胺；

[0125]

组2：分两次加入，自加入诱导剂起，每两小时加入一次烟酰胺，使每次加入后，烟酰胺终浓度为500mg/l；

[0126]

组3：分四次加入，自加入诱导剂起，每一小时加入一次烟酰胺，使每次加入后，烟酰胺终浓度为250mg/l。

[0127]

定时取样，hplc检测nr的合成情况。结果显示，烟酰胺分四次加入，每一小时加入终浓度250mg/l方式，重组菌株nr007的nr合成量更高，诱导24h后nr产量可达980mg/l。

[0128]

实施例7：调整基因表达强度提高nr合成能力

[0129]

按照实施例1～4的策略构建重组菌株，区别在于，如表5所示，在菌株nr007的基础上，将nad

+

衍生物合成质粒由pet28a更换为prsfduet-1，和/或将转运蛋白和nr合成质粒由原来的pacycduet-1更换为pcdfduet-1，获得的重组菌株命名为nr008、nr009、nr010。

[0130]

将重组菌株划线于适当抗性的lb固体平板上，37℃过夜培养；挑选单菌落接种于含有相应抗性的lb培养基中，37℃，220r/min，培养10～12h；按照2％转接量转接至30ml发酵培养基1中，37℃培养至od

600

为0.6～1.0时，30℃条件下诱导蛋白表达。加入终浓度0.5mm iptg，烟酰胺分四次加入，每一小时加入终浓度250mg/l，定时取样，hplc检测nr的合成情况。结果如图6所示，在诱导24h后，重组菌株nr007-nr010分别可以积累971mg/l、951mg/l、1031mg/l、1096mg/l，在nr的合成能力上重组菌nr010更强，相比较nr007、nr008、nr009分别提高12.9％、15.2％、6.3％。重组菌株nr010相比于nr007提高了nr合成质粒的拷贝数，说明提高nr合成质粒表达能力更有利于nr的胞外积累。

[0131]

表4重组菌及质粒信息

[0132]

重组菌名称包含的质粒nr007pet28a+baprs+vpnadv，pacycduet+usha+bmpnucnr008prsfduet+baprs+vpnadv，pacycduet+usha+bmpnucnr009prsfduet+baprs+vpnadv，pcdfduet+usha+bmpnucnr010pet28a+baprs+vpnadv，pcdfduet+usha+bmpnuc

[0133]

实施例8：消除nad

+

衍生物转运蛋白进一步提高nr胞外合成量

[0134]

bmpnuc作为nad

+

衍生物的转运蛋白，可以有效的将胞内nad

+

衍生物转运至胞外。但是同时增加了菌体的代谢负担，bmpnuc对nr生物合成的作用也需要进行确认。将重组质粒pcdfduet+usha+bmpnuc中的bmpnuc通过pcr方式去除，获得重组质粒pcdfduet+usha，将实施例1构建的nad

+

衍生物合成质粒pet28a+baprs+vpnadv和nr合成质粒pcdfduet+usha转化入f010(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δdeod、δpnuc、δriha、δrihb、δrihc)中，获得重组菌株nr011。

[0135]

将重组菌株nr011划线于适当抗性的lb固体平板上，37℃过夜培养；挑选单菌落接种于含有相应抗性的lb培养基中，37℃，220r/min，培养10～12h；按照2％转接量转接至30ml发酵培养基1中，37℃培养至od

600

为0.6～1.0时，30℃诱导蛋白表达。加入终浓度0.5mm iptg，加入1.0g/l烟酰胺，定时取样，hplc检测nr的合成情况。结果如图7所示，重组菌株nr011在nr的合成能力上更强，可以合成1610mg/l nr，nr的胞外合成量提高43.4％。说明nad

+

衍生物转运蛋白在nr合成上没有起到积极作用，反而由于增加代谢压力抑制了nr的生物合成。

[0136]

实施例9：菌株nr004扩大培养合成nr

[0137]

为进一步提高nr的产量，利用5l发酵罐进行扩大培养。在更大的发酵规模下，控制发酵过程中的ph、溶氧、生物质浓度等，使菌体的生长环境更好，获得更高的nr产量。将实施例8构建的nr011从甘油管中划线于含有相应抗性的平板，37℃，培养12h；挑选单菌落接种于含有相应的液体lb中，37℃，220r/min培养10h，按照5％～20％转接量转接至装有5l发酵培养基2的发酵罐中，初始条件：ph用35％氨水控制在6.0～7.0，通气量1vvm～2vvm，转速300r/min～1000r/min与溶氧do关联控制在30％～50％，用补料培养基控制葡萄糖的浓度维持在5g/l以下。待出现do反弹时，降温至25℃～30℃用0.5mm～1mm的iptg诱导，并分别在诱导0h、2h、4h、6h、8h加入终浓度2g/l的烟酰胺(总量共计10g/l)。离心取上清，hplc检测产量浓度。结果显示(图8)，诱导40h可使nr积累量达到9g/l以上，后续胞外nr的积累量基本稳定，od达20～40。

[0138]

实施例10：菌株nr004扩大培养合成nr

[0139]

具体实施方式同实施例9，区别在于，在iptg诱导的同时通过流加的补料方式添加底物烟酰胺，控制烟酰胺的浓度维持在相对低的浓度(＜3g/l)。结果如图9显示，诱导40h可使nr积累量可达20g/l以上，发酵48h后胞外nr的积累量基本稳定，od达20～40。

[0140]

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

 

 

技术特征：

1.一株可利用烟酰胺合成烟酰胺核糖苷的重组菌，其特征在于，在出发菌株的基础上，过表达5'-核苷酸酶基因usha，并敲除嘌呤核苷磷酸酶基因deod、烟酰胺核糖苷转运体基因pnuc、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因riha、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb和核糖核苷水解酶基因rihc。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌株过表达烟酰胺磷酸核糖基转移酶和prpp合酶。3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌。4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌株为大肠杆菌f004。5.根据权利要求1～4任一所述的重组菌，其特征在于，以pacycduet-1或pcdfduet为载体，表达usha基因。6.根据权利要求1～5任一所述的重组菌，其特征在于，以pet-28a(+)或prsfduet为载体，表达baprs基因和/或vpnadv基因。7.一种促进重组大肠杆菌合成烟酰胺核糖苷的方法，其特征在于，在大肠杆菌中过表达烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因vpnadv、prpp合酶基因baprs、烟酰胺单核苷酸转运体基因bmpnuc和5'-核苷酸酶基因usha基因，并敲除pncc基因、deod基因、pnuc基因、riha基因、rihb基因和rihc基因。8.一种以烟酰胺为底物生产烟酰胺核糖苷的方法，其特征在于，将权利要求1～6任一所述的重组菌在35～37℃培养一段时间后，用iptg诱导生产烟酰胺核糖苷，并加入底物烟酰胺。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在加入诱导剂后，将烟酰胺一次性或分批加入至培养基中。10.权利要求1～6任一所述的重组菌在食品、保健品、药品、化妆品、或饲料领域制备含烟酰胺核糖苷的产品中的应用。

 

技术总结

本发明公开了一种产烟酰胺核糖苷的重组菌，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过利用NAD衍生物高产重组大肠杆菌，强化向NR转化的酶基因ushA，并敲除deoD基因、rihA基因、rihB基因、rihC基因、pnuC基因，消除NR降解路径并切断NR向胞内转运路径，实现NR的生物合成。本发明还通过调整基因表达强度，进一步提高NR在胞外的积累，并通过优化发酵条件，使NR的积累量得到进一步提高，在5L发酵体系下可获得20g/L以上的NR，在食品、药品、化妆品、饲料、纺织品领域具有广泛的应用前景。纺织品领域具有广泛的应用前景。纺织品领域具有广泛的应用前景。

 

 

技术研发人员：周景文 陈坚 黄忠实 曾伟主

受保护的技术使用者：江南大学

技术研发日：2022.05.05

技术公布日：2022/8/5