图1. 四种来源二肽酶的酶学性质和转化能力
近日，江南大学生物工程学院饶志明教授及其团队在《Bioresource Technology》杂志发表题为“Combinatorial protein engineering and transporter engineering for efficient synthesis of L-Carnosine in Escherichia coli”的研究论文，该研究通过基因组挖掘从粘质沙雷氏菌中筛选出二肽酶(SmpepD)，构建L-肌肽合成细胞工厂。随后，通过合理设计SmPepD，获得双突变体T168S/G148D，使L-肌肽产量提高41.6%。然后，删除L-组氨酸输出基因yeaS，以进一步增加L-肌肽的产量。最后，在优化条件下，在5L生物反应器中进行一锅生物转化生产L-肌肽，产率为133.2 mM。本研究达成了微生物合成L-肌肽的最高产率，为L-肌肽的工业化生产提供了一条生物合成途径。
图2. 保守残基的测定和突变位点的选择
为了获得高效的L-Car生物催化剂，研究者首先从大肠杆菌、粘质葡萄球菌苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，四个来源中选取酶进行筛选。研究者测试了四种来源的二肽在不同温度、pH和金属离子种类条件下的比酶活性。四种酶的最适温度均为45℃，最适pH为8.0。选择Mn2+、Na+、Fe2+、Zn2+四种金属离子，发现Mn2+对SmpepD、BcpepD、EcpepD具有较好的活化能力，而BtpepD在Fe2+存在下具有较高的酶活性。其次，通过对其酶学性质的研究，验证了它们在充分底物条件下的转化能力。结果表明SmpepD酶活性和转化能力最好。综上所述，SmpepD的最适温度和pH较为适中，其比酶活性在4种酶中最高。在合成过程中，SmpepD的转化能力最好。因此，研究人员将SmpepD作为是后续转化的最佳关键酶。此外，在转化反应结束时，体系中仍有底物残留，说明催化反应可能因转化后期酶活性降低而结束。因此，研究人员将通过蛋白质工程进一步修饰SmpepD，以获得具有高酶活性的突变体。
图3. 野生型和M26突变体结构信息和酶学特性的比较
为了提高酶的活性，研究人员用计算机辅助设计对酶进行了修饰。其首先对粘质葡萄球菌、溶藻弧菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的PepD序列进行了多次序列比较，以确定保守的氨基酸残基。黏质葡萄球菌与溶藻弧菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的序列一致性分别为61.22%、36.61%、79.01%和36.01%。研究人员进一步利用AlphaFold2.3构建PepD蛋白的结构模型，利用AlphaFold2.3.1进行结构建模，pLDDT评分大于95.4。并将SmpepD与小分子配体进行分子对接。结果表明，残基D115、E145、E146、D169、E171和G431与小分子配体上的羟基和氨基形成氢键，而残基E115、D169、E145、E146和E171与小分子配体上的羟基和氨基形成盐桥。通过上述残基与小分子配体形成的相互作用研究人员确定了PepD的活性中心，并进一步在距离活性中心8 Å的范围内寻找与催化活性相关的待突变残基。此外，研究人员利用基于进化信息评分的PSSM来识别可发生突变的残基位点。研究人员通过计算机辅助突变预测，鉴定出V80、D115、N116、G148、M149、T168、E171、L432、I453、P456等10个突变位点，并进行了经验分析。随后构建了30个单点突变体，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达。研究者在单点突变体构建完成后，进行酶活性测定，L432F、T168S、N116S、E171Q、G148D和G148S比酶活性分别比WT高13%、33%、16%、24%、22%和26%。因此，研究者选择这些突变体进行下一个实验。为了进一步提高酶的活性，研究人员进行了序列组合突变。在两点突变体中，M16、M25、M26和M36的酶活性均高于WT，其中M26突变体的酶活性最高，提高了约41.6%。在此基础上，研究人员利用良好的突变位点构建三点突变体，这些酶都没有M26突变体那么活跃。在所有三点突变体中，酶活性均较野生型降低，其中最低的是M123，仅为野生型的35。多点组合突变后，酶活性的下降更为明显。研究人员认为这可能是由于多点突变的引入导致酶的灵活性发生变化，蛋白质整体结构不合理，导致催化活性下降。
图4. yeaS基因存在对L-组氨酸含量和L-肌肽生成的影响。
为了探究突变体酶活性高于野生型的原因，研究人员分析了两种突变体的动力学参数和结构。首先，其系统地检测了WT和M26突变体的酶学特性和酶反应动力学参数。WT和M26的最适温度为45℃，最适pH为8.0。此外，温度和pH稳定性变化不大。从反应动力学参数来看，β-Ala和L-His的WT Km明显大于M26，分别是M26的2.18倍和1.50倍，说明M26对这两种底物具有更高的亲和力。M26对β-Ala的催化效率常数(Kcat/ Km)是WT的2.1倍，而对L-His的Kcat/Km是WT的1.74倍，对L-His的Kcat/Km是WT的7.94倍。在合成反应中，M26的表现明显优于WT，说明这两种氨基酸的突变表现优于WT主要是通过提高酶对底物的亲和力和催化效率。与WT相比，M26突变体的特异酶活性有了很大的提高。为了阐明活性增强的分子机制，研究人员对WT和M26突变体的对接结果进行了分析。两点突变改善了PepD与多个结合位点残基的相互作用。突变后，D78、E145和E146与小分子配体形成离子相互作用，由于离子键比氢键强大得多，可以形成更稳定的结构，残基与配体之间的相互作用更强、更有利。D115、D169和H457的氢键明显减少，取而代之的是相互作用更强的离子相互作用，这也增加了蛋白质与配体之间的亲和力。WT和M26突变体突变位点与小分子配体之间的相互作用，这也可以侧面验证酶活性增加的原因。上述结果表明，突变G148和T168均具有提高酶活性的有利作用。研究人员进一步对WT和M26突变体进行了分子动力学(MD)模拟，以获得酶在构象和原子水平上的细微变化信息。分析突变对复合物均方根波动(RMSF)变化参数的影响。RMSF通过提供每个残基的运动信息来反映模拟过程中蛋白质的灵活性。根据RMSF结果分析， M26的RMSF高于WT，说明突变体的蛋白结合袋的柔韧性增强，更有利于蛋白结合袋内残基与底物的相互作用，从而提高了反应的催化效率。转运体工程是增加L-肌肽产量的有效策略。在蛋白质工程应用的基础上，研究人员继续应用转运体工程进一步提高L-肌肽的产量。研究人员首先构建了过表达yeaS的重组菌株，与野生型菌株相比，L-Car的产量从53.0 mM下降到15.9 mM。敲除yeaS后，与野生型菌株相比，L-Car的产量从53.0 mM增加到78.7 mM，增加了48.3%。
图5. 全细胞转化条件不同变化对L-肌肽合成的影响
为了研究L-肌肽产量增加的原因，在全细胞生物转化后，研究人员测定了敲除及未敲除大肠杆菌细胞内和细胞外的L-His含量。与未敲除大肠杆菌相比，敲除后的大肠杆菌细胞外L-His含量降低了8%，而过表达yeaS的大肠杆菌细胞外L-His含量增加了11%。敲除后的大肠杆菌胞内L-His含量最高，过表达的大肠杆菌胞，细胞内L-His含量极低，比敲除后大肠杆菌低98%。说明敲除yeaS直接导致细胞内L-His积累，从而增加L-肌肽的产生。这是首次发现YeaS可增加细胞内L-His含量，敲除的YeaS能够显著增加L-肌肽的产生。这一策略可以进一步增加L-肌肽的积累，以实现规模化生产。全细胞催化的步骤简单，适合工业生产，不需要细胞破坏和酶纯化。而全细胞催化的条件对生产至关重要。因此，在获得重组菌株后，研究人员进一步对反应体系的参数进行优化，以提高转化效率。研究人员研究了不同温度对L-肌肽全细胞催化合成的影响。当系统温度控制在45℃时，L-肌肽的产率最高，当温度高于45℃时，L-肌肽的产率随温度的升高而降低。细胞生物量是全细胞生物转化的关键参数。在实际工业生产中，在反应过程中对生物质进行控制，可以有效降低成本，提高产量。L-肌肽浓度在OD600 = 20时最高，随着细胞生物量的进一步增加而降低。底物的摩尔比对反应有很大的影响。当底物摩尔比控制在1:20时，底物转化率最高，其中β-Ala浓度为5.6 M, L-His浓度为0.27 M，当底物摩尔比控制在1:20时，底物转化率最高。然而，进一步的摩尔比导致摩尔转化率降低，表明过量底物对细胞的负面影响。在上述条件下，Mn2+的加入浓度为1mM，酶表现出较强的催化性能，浓度过低或过高都不利于L-肌肽的合成。研究人员在5L生物反应器中，进一步验证了重组菌株的性能，在最佳反应条件下，L-肌肽的摩尔转化率为49.3%，产量达到133.2 mM，为目前文献报道的最高产率。
