乳糖-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose LNnT)是一种丰富的母乳寡糖(HMO),已被批准作为婴儿配方奶粉的新型功能添加剂,其生物合成引起了广泛的关注。其中,大肠杆菌合成LNnT是以甘油作为碳源进入细胞生成两个重要前体5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)和UDP-半乳糖(UDP-galactose,UDP-Gal)。然后UDP-GlcNAc与外源添加的乳糖在外源引入的β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶LgtA催化下生成中间体LNTII。最终LNTII与UDP-Gal在外源引入的β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB催化下生成LNnT。LNnT的生产通常伴随大量LNTII积累。
近日,江南大学吴敬等在《J. Agric. Food Chem.》发表文章“High-Level Production of Lacto-N-neotetraose in Escherichia coli by Stepwise Optimization of the Biosynthetic Pathway”,改造大肠杆菌构建了高产LNnT,低残余LNT II的生产菌株。首先失活了lacA、lacZ、wecB、nagB、gcd 和ugd基因阻断了乳糖、UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-半乳糖分解途径,再引入β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶LgtA和β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB,构建了能够生产LNnT的底盘菌株。随后,为增强UDP-GlcNAc和UDP-Gal合成路径,过表达了glmM、glmU-S*、galE。接下来通过过表达乳糖内运蛋白lacY,失活LNT II外运蛋白SetA增加了乳糖和LNTII供应。UDP-GlcNAc和UDP-Gal的生物合成需要三磷酸尿苷(Uridine triphosphate, UTP),细胞内UTP的合成以5-磷酸核糖-α-焦磷酸(5’-phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)作为前体, 因此过表达了PRPP合酶基因prs基因以增加UTP的供应。经过上述改造LNnT滴度仍相对较低,因此将LNnT合成途径分为三个模块: 由lgtA,glmU-S*和glmM编码的LNT II合成模块、由lgtB、pgm、galE和galU编码的LNnT合成模块和由lacY和prs编码的协调输送模块。以不同拷贝数的质粒进行组合表达显著提高了LNnT产量,获得菌株LNnT产量最高为5.96 g/L,残余1.36 g/L LNT II。最后,通过调节必需基因lgtB,prs和lacY的翻译起始强度微调通路通量。最终,LNnT在摇瓶中的产量达到6.70 g/L,残余0.80 g/LLNT II。在3 L生物反应器中达到19.4g/L,生产强度为0.47 g/(L h),LNT II残留量为1.79 g/L ,生产强度水平为目前报道最高,LNT II残留量迄今为止最低。