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江大吴敬等改造大肠杆菌选择性高产乳糖新四糖 发酵水平19.4g/L

   日期:2023-10-25     来源:湖州中科    浏览:1512    评论:0    
核心提示:最后,通过调节必需基因lgtB,prs和lacY的翻译起始强度微调通路通量。最终,LNnT在摇瓶中的产量达到6.70 g/L,残余0.80 g/LLNT II。在3 L生物反应器中达到19.4g/L,生产强度为0.47 g/(L h),LNT II残留量为1.79 g/L ,生产强度水平为目前报道最高,LNT II残留量迄今为止最低。
  
  摘译自High-Level Production of Lacto-N-neotetraose in Escherichia coli by Stepwise Optimization of the Biosynthetic Pathway | Journal of Agricultural and Food Chemistry (acs.org)

乳糖-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose LNnT)是一种丰富的母乳寡糖(HMO),已被批准作为婴儿配方奶粉的新型功能添加剂,其生物合成引起了广泛的关注。其中,肠杆菌合成LNnT是以甘油作为碳源进入细胞生成两个重要前体5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)和UDP-半乳糖(UDP-galactose,UDP-Gal)。然后UDP-GlcNAc与外源添加的乳糖在外源引入的β-13-N-乙酰葡糖胺基转移酶LgtA催化下生成中间体LNTII。最终LNTIIUDP-Gal在外源引入的β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB催化下生成LNnTLNnT的生产通常伴随大量LNTII积累。

近日,江南大学吴敬等在《J. Agric. Food Chem.》发表文章High-Level Production of Lacto-N-neotetraose in Escherichia coli by Stepwise Optimization of the Biosynthetic Pathway”,改造大肠杆菌构建了高产LNnT,低残余LNT II的生产菌株。首先失活了lacAlacZwecBnagBgcd ugd基因阻断了乳糖、UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-半乳糖分解途径,再引入β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶LgtAβ-1,4-半乳糖基转移酶LgtB,构建了能够生产LNnT的底盘菌株。随后,为增强UDP-GlcNAcUDP-Gal合成路径,过表达了glmMglmU-S*galE。接下来通过过表达乳糖内运蛋白lacY,失活LNT II外运蛋白SetA增加了乳糖和LNTII供应。UDP-GlcNAcUDP-Gal的生物合成需要三磷酸尿苷(Uridine triphosphate, UTP),细胞内UTP的合成以5-磷酸核糖-α-焦磷酸(5-phosphoribosyl pyrophosphatePRPP)作为前体因此过表达了PRPP合酶基因prs基因以增加UTP的供应。经过上述改造LNnT滴度相对较低,因此将LNnT合成途径分为三个模块lgtAglmU-S*glmM编码LNT II合成模块、由lgtBpgmgalEgalU编码LNnT合成模块lacYprs编码的协调输送模块。以不同拷贝数的质粒进行组合表达显著提高了LNnT产量,获得菌株LNnT产量最高为5.96 g/L,残1.36 g/L LNT II最后,通过调节必需基因lgtBprslacY的翻译起始强度微调通路通量。最终,LNnT在摇瓶中的产量达到6.70 g/L,残余0.80 g/LLNT II。在3 L生物反应器中达到19.4g/L,生产强度为0.47 g/L h),LNT II残留量为1.79 g/L ,生产强度水平为目前报道最高,LNT II残留量迄今为止最低。

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