紫杉醇是全球销量第一的植物抗癌药物，而且随着癌症防治需求的日益增加，紫杉醇成为全球销量第一的植物抗癌药，预期其市场规模在2030年以后将达到近千亿人民币规模。自从1971年鉴定化学结构以来，紫杉醇已发展成为同青蒿素齐名的、教科书级别的经典植物天然产物的代表。半个世纪以来，紫杉醇生物合成途径依然未被完全解析，成为科学界一直关注的难点。
近日，中国农业科学院（深圳）农业基因组研究所（以下简称“基因组所”）领衔，联合北京大学、清华大学等国内外六家单位在国际顶级学术期刊Science以长文形式发表了题为“Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III”的研究论文。该工作在研究团队前期绘制的高质量红豆杉基因组的基础上，成功发现了紫杉醇生物合成途径中最具挑战的未知酶，阐明了颠覆传统认知的植物含氧四元环结构的形成机制，建立了紫杉醇生产前体巴卡亭III的异源生物合成路线。该研究成果解决了紫杉醇生物合成的世纪难题，突破了合成生物学技术实现紫杉醇绿色可持续生物制造的关键瓶颈。
Bin Jiang et al. ,Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III.Science,eadj3484. DOI:10.1126/science.adj3484
紫杉醇的生产高度依赖关键前体化合物巴卡亭III的植物提取。紫杉醇来源于珍稀濒危裸子植物红豆杉。红豆杉是我国一级珍稀濒危保护植物，素有“植物大熊猫”之称。我国紫杉醇原料药主要依靠人工种植的红豆杉植物提取紫杉醇前体结合化学半合成获得。通过采集人工培育的红豆杉枝叶等材料，利用多种萃取和分离方法，提取紫杉醇前体分子，包括巴卡亭Ⅲ或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ，再通过简单的化学合成过程，即在前体分子的C13位接上一条化学合成的侧链，从而生产紫杉醇原料药。其中，化学半合成过程技术成熟，成本可控，因此，关键前体物质巴卡亭III的稳定获取是决定紫杉醇生产成本的关键。由于前体巴卡亭III的提取高度依赖有限的红豆杉植物资源，而且红豆杉生长速度缓慢，一般成树需要几十年甚至上百年，同时紫杉醇类物质在红豆杉植物中的含量极低，这些因素造成了紫杉醇药物生产成本高昂，让我国人民不得不承受昂贵的治疗费用，而且药物供给很难满足我国日益严峻的癌症防控的需要，还容易引发生态破坏和耕地占用等诸多问题。
紫杉醇生物合成途径解析与异源重建是解决紫杉醇供应不足和打破国际技术垄断的关键突破口。由于红豆杉植物的稀缺性及紫杉醇药物的不可或缺性，世界各国，尤其是癌症大国都在积极推动相关研究与产业发展。特别是美国，自上世纪60年代开始至今，一直主导着紫杉醇的科技前沿，美国科学家们最早从红豆杉分离和鉴定了紫杉醇，首次阐明了紫杉醇的独特抗癌机理，成功开发了巴卡亭III生产紫杉醇的半路线等。当前，随着合成生物学与绿色生物制造技术的发展，将红豆杉中编码巴卡亭III合成的基因导入微生物或植物底盘中进行异源生产，成为最具潜力的紫杉醇可持续生产路线。可是，自紫杉醇发现以来的半个世纪里，共鉴定出近20个紫杉醇合成相关基因，全部由欧美研究团队主导完成。最先进的紫杉醇提取技术、核心的红豆杉细胞生产技术和基因工程技术等，依然牢牢掌控在欧美制药公司的手中，如美国的百时美施贵宝制药公司，法国的赛诺菲公司，德国Phyton公司等。我国要在紫杉醇绿色制造的道路上走的好，满足人民群众的健康需要，只能也必须靠自主研发，迎难而上。
打通紫杉醇的生物合成途径成为世界难题。自1971年首次确定紫杉醇结构以来，阐明其生物合成途径一直是天然产物研究中的一项挑战性任务。紫杉醇的生物合成途径高度复杂，需要经历多次羟化、酰化、环氧化等酶促反应，才能最终形成。一般认为，紫杉醇的生物合成途径涉及20步酶促反应。其生物合成途径可分为三个关键过程，首先从底物香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）形成带有三环二萜的紫杉烷骨架（包含4(20)-烯-5 -醇结构单元），再通过独特的氧杂环丁烷化作用及酰基化作用形成巴卡亭III，最后将苯基异丝氨酸侧链连接到巴卡亭III的C13位置生成紫杉醇。其中侧链的形成及其与巴卡亭III结合产生紫杉醇的过程已清晰，但形成巴卡亭III 的几个关键步骤仍然未知，尤其是负责氧杂环丁烷环的形成和C9的氧化的通路酶。因此，缺失的酶使得紫杉醇生物合成的上下游途径无法联系起来，导致半个世纪以来，还没有科学家解析完整的紫杉醇生物合成途径，使其成为领域内的重大难题。
突破之路，始于首张南方红豆杉基因组蓝图。为了解开这一难题，基因组所闫建斌研究员领衔于2021年率先绘制国际首张染色体级别的南方红豆杉高质量参考基因组图谱，鉴定出红豆杉独有的紫杉醇生物合成相关基因家族，并揭示了紫杉醇合成相关基因的全基因组定位与茉莉素介导的协同表达调控规律，鉴定了首个紫杉醇生物合成基因簇，为紫杉醇生物合成途径的解析提供了基因组学蓝图和关键候选基因（Nature Plants, 2021,7(8): 1026, 封面论文）。
发现最具挑战的未知酶，鉴定紫杉烷氧杂环丁烷合成酶。紫杉醇分子中的氧杂环丁烷是极其独特的化学基序，由1个氧原子和3个碳原子形成的四元环结构，是紫杉醇抗癌活性的必要化学结构。研究者们基于红豆杉生物合成相关基因家族与紫杉烷分子结构分析，通过自主建立的多基因高效筛选技术，进行了大量的筛选和验证实验，最终从58个关键候选基因中，成功发现了能够催化氧杂环丁烷合成的细胞色素P450酶，命名为TOT1（紫杉烷氧杂环丁烷合酶，Taxane Oxetanase 1）（图1）。TOT1属于红豆杉所特有的CYP725A蛋白亚家族，在红豆杉细胞中敲低该基因的表达量，能够显著降低巴卡亭III和紫杉醇的生物合成。
图1 | 紫杉烷氧杂环丁烷合酶的筛选与鉴定
颠覆传统认知，阐明植物含氧四元环结构的生物合成新机制。传统观点认为，紫杉醇氧杂环丁烷的形成涉及两步过程：首先，4(20)-烯- -基乙酸酯分子结构（简称双键结构）被环氧化，生成 -环氧--乙酰氧基三元环中间体（称为环氧化物环），然后通过重排反应从环氧化物生成氧杂环丁烷四元环。也就是说，环氧化物的形成是生成氧杂环丁烷的先决条件。然而，本研究发现TOT1并不能催化三元环中间体向四元环的转变，而是将双键结构同时转变为三元环和四元环结构，从而证明了环氧化物不是氧杂环丁烷形成的必要中间体（图2）。
图2 TOT1催化双键结构同时生成三元环和四元环产物
通过密度泛函理论（DFT）计算与酶的底物选择性检测，研究者们进一步揭示了环氧化物和氧杂环丁烷都可以通过 TOT1 酶中的羰基离子中间体（Int1）产生，但氧杂环丁烷产物的生成在能量和动力学上都比环氧化物更有利，解释了氧杂环丁烷为优势产物的分子机制。这一研究结果，改变了30年来人类对于该结构生成机制的传统认知，填补了仅在植物界中存在的环扩张反应生成含氧四元环结构的分子机制的缺失（图3）。
图3 TOT1介导氧化反应的反应能分布图
另辟蹊径，鉴定缺失的C9氧化酶。在过去三十年中未能鉴定催化C9氧化的酶的主要原因是难以分离C9位的未被氧化的中间体。研究者们发现C9氧化酶不仅参与紫杉醇的生物合成，还参与另一条重要紫杉烷合成途径紫杉素的合成。而且，在紫杉素的合成途径中，除了未知的C9氧化酶外，其他催化酶均已被报道，包括萜烯合成酶TXS、羟化酶 、 、 和乙酰转移酶TAT1/2/3/4。研究者们因此创造性的构建了紫杉素的生物合成植物底盘，并结合生物信息学候选基因分析，利用该底盘从17个候选基因中筛选出了负责紫杉烷 C9 位氧化的酶（Taxane hydroxylase 1， ）（图4）。该基因位于红豆杉的9号染色体上，介于 和 两个已知的紫杉醇合成基因之间。此外，这一鉴定思路弥补了在很多情况下底物不适于筛选酶的方法的不足，为后续紫杉烷或其他天然产物合成酶的鉴定提供了新的思路。
图4 | 紫杉烷C9氧化酶的筛选与鉴定
异源重建，打通紫杉醇生产前体巴卡亭III的生物合成途径。利用人工异源合成途径构建策略，研究者将新鉴定的TOT1和 与其他7个已知合成基因（ ）组合在一起，在植物底盘中进行途径重建，成功生成了巴卡亭III。证明了巴卡亭III分子可由着9个核心基因合成。进一步研究显示，这些核心基因受到植物激素茉莉素的共表达调控，具有相似的诱导表达模式和显著的表达相关性，证明这些基因在细胞中受到密切的协同调控。结合亚细胞定位分析等实验结果，该研究绘制出了巴卡亭III的完整生物合成过程，即起始底物GGPP在叶绿体中被TXS酶催化形成紫杉二烯，随后，紫杉二烯通过质体-内质网的接触点转移到细胞质之后，受到内质网锚定的六个氧化酶（ 和 TOT）与两个细胞质定位的酰基转移酶（TAT和TBT）的协同催化，最终生成了巴卡亭III（图5）。
图5 | 巴卡亭III的完整生物合成过程
综上，该研究结合多组学分析和大量功能验证，成功鉴定了紫杉醇生物合成途径的关键缺失酶，揭示了植物细胞催化氧杂环丁烷结构形成的全新机制，并通过9个酶在植物底盘中实现了紫杉醇前体巴卡亭III的生物合成，为紫杉醇的大规模生产奠定了基础，也为上百种紫杉烷类天然产物的生物合成通路解析提供了理论指导，标志着我国在复杂天然产物合成通路解析方面的理论和技术站在了世界前沿位置。而且，相关研究成果催生的知识产权，成为我国突破紫杉醇生物合成技术封锁线的重要抓手，为我国的紫杉醇合成底盘改造提供数据和专利保障，为我国的紫杉醇绿色制造产业化铺平道路。
中国农业科学院（深圳）农业基因组研究所为第一单位。基因组所闫建斌研究员和北京大学雷晓光教授为论文的共同通讯作者，基因组所硕士毕业生蒋彬、北京大学高磊特聘副研究员和博士研究生王海军、基因组所博士研究生孙亚平为该论文的共同第一作者。谢道昕院士以及黄三文院士为该研究提出了重要指导。项目资助的第一标注为合成生物学国家重点研发计划。
专家点评
中国科学院院士 赵国屏
“紫杉醇是人类迄今为止开发的最有效的抗癌天然产物药物，其异常复杂化学结构决定了生物合成途径解析的空前难度。在过去数十年的时间里，欧美国家已解析了合成途径涉及的多个细胞色素 P450 单加氧酶、酰基转移酶和变位酶等，但仍因部分关键功能基因未被鉴定，导致合成通路不完整。该工作综合利用基因组学、代谢组学、生物化学、分子生物学、合成生物学的技术手段，成功解析了紫杉醇合成途径中尚未被发现的若干关键催化酶，并利用植物底盘实现了合成路线的人工重构。闫建斌研究员领衔完成的这一研究成果结束了阐明紫杉醇生物合成途径的漫长研究历史，标志着在天然化合物生物合成途径解析以及人工底盘通路重构方面的教科书式的突破；也生动代表着我国一批中青年科学家，在合成生物学领域探索奋斗近二十年所达到的里程碑式新高度。相信只要在“会聚研究“方向上继续辛勤耕耘、协同攻关，我们一定能取得对生命本质的新认识，开拓合成生物制造的新前景。”
中国科学院院士 陈晓亚
“紫杉醇是世界著名的植物抗癌天然产物药物，临床上用于治疗多种癌症，由于在植物中含量很低，十分珍贵。自1971 年紫杉醇结构鉴定以来，其生物合成途径一直没有打通。闫建斌课题组及合作者们成功鉴定了紫杉醇生物合成途径中缺失的关键酶，揭示了紫杉醇氧杂环丁烷成环的酶学机制，发现了紫杉醇前体巴卡亭III的最短异源生物合成路线，实现了紫杉醇生物合成途径的重构。该研究是植物代谢生物学与合成生物学领域的重大突破，为利用合成生物学技术实现紫杉醇的绿色可持续生产铺平了道路。”
中国科学院院士 邓子新
“癌症是危害我国人民健康与生命的大敌，防治癌症已上升为国家战略。世界销量第一的抗肿瘤天然产物药物是紫杉醇，但其生产仍然依赖有限的红豆杉天然资源。开发绿色环保的紫杉醇生物合成策略对于我国的癌症防治战略具有重大意义。半个世纪以来，紫杉醇生物合成领域的前沿突破主要由欧美国家的科学家主导完成，闫建斌课题组及合作者们继率先绘制完成国际首张南方红豆杉基因组图谱之后，进一步破解了长期以来紫杉醇生物合成途径的“卡脖子”难题，鉴定了最具挑战的未知合成酶，实现了紫杉醇关键生产前体合成路线的人工重构。该研究实现了紫杉醇合成生物学领域的引领性原创成果重大突破，为实现我国紫杉醇生物智造的自立自强奠定了坚实基础，具有里程碑意义。”
美国两院院士 Jens Nielsen
（瑞典查尔姆斯理工大学终身教授，美国科学院、美国工程院、中国工程院等八个国家级科学院或工程院的院士或外籍院士，诺贝尔奖评审委员会委员、国际代谢工程协会创会主席）
“Natural products produced by plants serve an important role in medicine, food and agriculture. The biosynthesis of these molecules is often involving many different chemical steps and the enzymes catalyzing these steps have in many cases not been identified. This hinders our ability to produce these valuable chemicals is sufficient amounts for the benefit of people and society. In this study of Professor Jianbin Yan they identified an important enzyme involved in biosynthesis of baccatin, an important anti-cancer drug. This finding is a major breakthrough in our understanding of the biosynthesis of complex natural products, and it will enable our abilities to produce other valuable natural products at scale and hereby develop new and valuable medicines.”
美国两院院士 Gregory Stephanopoulos
（美国麻省理工学院教授，美国科学院院士，美国国家工程院院士）
“It was first isolated in the bark of the Pacific Yew, and in the first years, it took several old trees to isolate enough material for the treatment of just a few cancer patients. This situation has since been corrected and the drug is now available in large quantities through various advances. Yet the elucidation of the metabolic pathway responsible for the synthesis of paclitaxel has been an unsolved problem for many years. This background makes the recent publication by the group of Professor Yan in Science a very important accomplishment indeed. The group succeeded in identifying the enzymes and genes that are responsible for the last two steps of key reactions in the synthesis of baccatin III, the key precursor in the taxol biosynthetic pathway. Doctor Yan and his group identified the taxol oxetanase that catalyzes the oxetane ring formation and another enzyme that is responsible for the taxane oxidation at the C9 position, thus they filled the gaps in the paclitaxel synthesis pathway. Besides constituting a very important contribution to basic science, this development is also significant for two additional reasons. First for opening the way for the more effective and cheaper synthesis of the taxol drug, but also for the new ability to synthesize many derivatives in search of more potent anti-cancer drugs.”
