维生素D3（VD3）是一种维持人体健康所必需的类固醇化合物，广泛应用于医药、食品和饲料等行业。前体化合物7-脱氢胆固醇（7-DHC）经光转化后可以直接合成VD3。目前7-DHC的制备方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，相较于化学合成法，微生物发酵法因具有环境友好、生产过程安全易控制等优势，受到研究者的广泛关注。但是，合成7-DHC的前体物质主要为固醇和萜类化合物，它们在胞内的大量累积易对细胞产生毒性，为避免或减弱这种毒害作用，细胞往往会将这些固醇和萜类化合物封存于某些具膜细胞器中。然而，这种封存会在空间上将前体物质与下游合成途径中的酶进行隔离，从而限制了目标产物的高效合成。
针对上述问题，该研究以前期一株可以合成7-DHC的酿酒酵母菌株为研究对象，首先，通过差速离心和可视化等技术，揭示了7-DHC的关键前体角鲨烯主要被封存在脂滴中，而将角鲨烯转化为7-DHC的后角鲨烯途径的相关酶主要位于内质网中，推测限制7-DHC高效合成的关键因素是脂滴对角鲨烯的封存作用；为此，本研究在脂滴中重构了后角鲨烯途径，获取的重组菌株胞内角鲨烯的含量降低了97%，摇瓶水平7-DHC的产量提升至684.1 mg/L。后续研究发现，后角鲨烯途径在脂滴中的重构会促使7-DHC在脂滴中贮存，这种贮存可以有效降低胞质7-DHC累积对细胞造成的毒害。为此，本研究一方面通过敲除TGL3减弱三酰基甘油降解，以增大脂滴中7-DHC的可储存空间，另一方面过表达ARE2加强酯化作用，以引导7-DHC更高效地储存于脂滴中，获得的重组菌株7-DHC的产量达到792.9 mg/L；最后，结合辅因子平衡优化，7-DHC在摇瓶水平的产量达到867.6 mg/L，3-L发酵罐中的产量达到5.1 g/L，这是迄今为止报道的最高产量。相关研究成果为构建可高效合成固醇类化合物的细胞工厂提供了重要参考。
上述研究工作得到了国家重点研发计划(2020YFA0908300)、中央高校基本科研基金(JUSRP202404017, JUSRP622004)等项目的资助。
图1 后角鲨烯合成路径中酶的细胞器定位
图2 在脂滴中重构后角鲨烯路径
图3 辅因子优化及高密度发酵生产7-DHC
