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随着合成生物学和代谢工程的进步,微生物发酵方法已成为大规模生产虾青素的一种重要策略。近日,中国药科大学团队在期刊Molecular Biotechnology发表研究综述Advances in metabolic Engineering for the Accumulation of Astaxanthin Biosynthesis,全面概述了虾青素生物合成的研究进展,重点介绍了天然宿主红法夫酵母以及异源宿主解脂耶氏酵母、酿酒酵母的应用,并讨论了未来的研究方向。
增强红法夫酵母虾青素生物合成的策略
经典诱导繁殖
传统诱变育种方法通过使用诱变剂如EMS和紫外线,能有效提升微生物产生虾青素的能力。例如,MNNG诱变和β-ionone筛选得到红法夫酵母M34,其虾青素产量显著提高。γ射线照射也可用于筛选高产菌株,诱导突变后,可通过阳性或阴性方法筛选高产虾青素突变体,或使用定量流式细胞术和细胞分选技术。原生质体融合是另一种诱变方法,但应用较少。尽管传统方法可获得高产菌株,但其随机性大,难以定向获得目标菌株,且过程劳动密集、周期长。目前,基因工程方法因其能在遗传水平上定向改造生物合成途径,已成为微生物改造的主流方法。
代谢工程策略
最大化流向IPP的碳通量
IPP及其异构体DMAPP是合成类胡萝卜素的基本构件,它们可以通过MVA途径和MEP途径生成。MEP途径通常存在于植物和原核生物中,而真核生物(如红法夫酵母)通常利用MVA途径将乙酰辅酶A转化为IPP,然后将其异构化为DMAPP。这一过程涉及糖酵解和三羧酸(TCA)循环,这些循环为虾青素的合成提供原料。因此,调节这些代谢途径可以显著影响虾青素的产量。
6-BAP等植物激素可以促进糖酵解,抑制TCA循环,增加乙酰辅酶A的供应,从而促进虾青素的形成;MVA途径还提供了合成IPP所需的G3P、丙酮酸和乙酰辅酶A,暗示内源性MVA水平的增加可以直接推动碳通量向IPP;HMG-CoA还原酶是虾青素生物合成中的限速酶,它催化从HMG-CoA产生甲羟戊酸;此外,IPP异构酶在将IPP转化为DMAPP的过程中起着关键作用,对于指导碳通量向虾青素的合成至关重要。
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增加β-胡萝卜素的积累
通过 GGPP 合酶催化将 FPP 的细胞内通量引导至虾青素生物合成途径,或引导至麦角甾醇的生物合成途径以产生副产物麦角甾醇。研究发现,过表达编码GGPP合成限速酶的crtE基因,可以增加虾青素含量。在红法夫酵母中,代谢通量通过植物烯合酶、植物烯去饱和酶和番茄红素环化酶的催化将GGPP转化为β-胡萝卜素。crtYB基因编码的植物烯合酶是这一过程中的双功能酶,对植物烯-β-胡萝卜素和β-胡萝卜素的合成至关重要。通过增加crtYB基因的拷贝数可以提高植物烯合酶的水平,从而显著增加虾青素含量。此外,删除或下调参与分流产物合成的基因,如红法夫酵母中的双CYP61基因,可以减少麦角甾醇的生物合成,增加通量向β-胡萝卜素转移,从而提高虾青素产量。crtI基因编码的植物烯合酶对类胡萝卜素合成至关重要,但其过表达可能会导致代谢通量转向甲苯合成,因此调整和修改crtI基因是一个挑战。通过这些策略,代谢工程在提高β-胡萝卜素产量方面发挥了重要作用,并为生产提供了另一条途径。
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增加虾青素生物合成模块的积累
虾青素合酶由红法夫酵母中的crtS编码,与细胞色素P450还原酶(crtR)一起,催化将β-胡萝卜素转化为虾青素的最后一步。这是虾青素生物合成中的限速步骤。有研究通过同源重组,删除了红法夫酵母野生菌株的crtR基因,crtR删除菌株积累了高水平的β-胡萝卜素和低水平的虾青素。因此,可以看出crtR对红法夫酵母至关重要,其缺失导致β-胡萝卜素积累并阻碍虾青素的合成。甾醇调节元件结合蛋白可以上调crtE和crtR基因的表达,并通过MVA途径积极调节β-胡萝卜素和麦角甾醇的生物合成,从而增加虾青素产量。
优化发酵条件
为了提高红法夫酵母的虾青素产量,优化生长环境是关键。通过调整培养基和控制温度(20-22°C)、pH值(生长初期5.8,虾青素生产5.0)和溶解氧水平,可以显著提升虾青素的积累。添加谷氨酸和Na2HPO4能增加类胡萝卜素产量,而谷氨酸还能促进糖酵解和TCA循环,提高虾青素积累速率;使用H2O2作为诱导剂可通过氧化应激增加虾青素含量;添加大豆油不仅能作为碳源,还能增加虾青素酯含量,促使游离虾青素积累;光刺激也能显著促进虾青素的合成,白光和紫外线刺激下虾青素产量能进一步提高。
利用组学技术
转录组学、蛋白质组学和代谢组学等组学技术已被应用于分析细胞变化和通路研究,以提高红法夫酵母的虾青素产量。代谢组学已被用于研究不同分子诱导剂对虾青素生成的影响,通过代谢组学分析发现,6-BAP促进糖酵解和MVA途径并促进虾青素的产生;柠檬酸钠通过调节TCA循环增加了虾青素合成的碳通量。蛋白质组学和转录组学分析显示,谷氨酸通过调节TCA循环和氨基酸代谢来刺激虾青素的生物合成,还有研究揭示了不同碳源对红法夫酵母代谢的影响。这些多组学技术为未来通过代谢工程提高虾青素产量提供了技术支持。
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增强解脂耶氏酵母和酿酒酵母虾青素生物合成的策略
增加乙酰辅酶 A 前体的供应
乙酰辅酶A是虾青素合成的关键前体,其供应增加可提升虾青素产量。柠檬酸途径和丙酮酸旁路是乙酰辅酶A的主要合成途径。6-BAP能促进相关途径,增加乙酰辅酶A含量,促进虾青素产生。在解脂耶氏酵母中,过表达乙酰辅酶A合成酶基因或ATP-柠檬酸裂解酶基因可增加乙酰辅酶A含量,提高角鲨烯和β-胡萝卜素产量。AMP脱氨酶的过表达通过抑制异柠檬酸脱氢酶活性,增加乙酰辅酶A产量,从而提高番茄红素含量。酿酒酵母中YPL062W基因的缺失增加了乙酰辅酶A的供应,提升了番茄红素产量。β-氧化途径的增强也能产生更多乙酰辅酶A。此外,阻断竞争途径和引入外源乙酰辅酶A再生途径可进一步增加其供应,从而提高萜类化合物如虾青素的产量。
增强MVA途径
MVA途径是虾青素合成的关键,其充足的代谢流量对虾青素积累至关重要。HMG-CoA还原酶是MVA途径中的首个限速酶,其过量表达可增强MVA途径,提高类胡萝卜素产量。GGPP合酶是另一限速酶,其过量表达可增加β-胡萝卜素产量。此外,过量表达MVA途径中的其他酶,如ERG13,也能增加β-胡萝卜素含量。NADPH是MVA途径的必需辅助因子,其供应增加可促进类胡萝卜素合成。然而,由于NADPH参与多个生物合成途径,提高NADPH水平并不总是有效。总体而言,通过增强关键酶表达和辅助因子供应,可以有效提高β-胡萝卜素和虾青素的产量。
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将 FPP 的通量重定向到 β-胡萝卜素合成途径
FPP是合成β-胡萝卜素、角鲨烯和麦角甾醇的共同前体。通过删除或下调竞争途径,可以将碳通量从FPP重定向到β-胡萝卜素。例如,通过替换或截短角鲨烯合酶的启动子来下调其表达,从而减少角鲨烯的合成,增加β-胡萝卜素的产量。添加麦角甾醇生物合成的抑制剂,也能促使更多FPP进入类胡萝卜素生物合成途径。此外,过量表达限速酶,如HMG-CoA还原酶,可以增加β-胡萝卜素的产量。在解脂耶氏酵母中,表达植物的植物烯合酶、去饱和酶和环化酶基因,以及共表达GGPP合酶和其他限速酶,可以有效地提高β-胡萝卜素前体的含量。
将 β-胡萝卜素重定向到虾青素合成途径
通过β-胡萝卜素羟化酶和酮化酶的作用,β-胡萝卜素可转化为虾青素。不同微生物源的这些酶在底物亲和力和活性上有所不同,影响β-胡萝卜素向虾青素的转化效率,发现特定组合能显著提高虾青素产量。增加虾青素合成基因的拷贝数和平衡酶活性对促进这一转化至关重要,通过优化这些基因的拷贝数,可以进一步虾青素产量。在酿酒酵母中,通过调节crtZ和crtW的比例,也能提高虾青素的产量。这些研究进展表明,通过基因工程手段可以显著提高虾青素的生产效率。
虾青素和脂质合成之间碳通量的合理分配
脂质合成与虾青素生物合成间存在复杂关系。解脂耶氏酵母和酿酒酵母利用乙酰辅酶A等前体物质合成脂质,这限制了虾青素合成途径的碳通量。类胡萝卜素的疏水性使其储存于脂质体和脂质膜中。提高细胞内脂质含量可增强类胡萝卜素储存,如有研究通过转化脂质过产菌株增强β-胡萝卜素合成;使用CRISPR技术筛选出新的工程靶点,通过适度上调脂质合成促进虾青素生产;通过控制培养基中的碳氮比优化了β-胡萝卜素的合成;通过基因修改和添加外源油酸增加了β-胡萝卜素含量。平衡脂质和类胡萝卜素合成的碳通量对提高虾青素产量至关重要。
蛋白质工程
酶融合策略通过调整酶的空间结构,应用于代谢工程,以增强虾青素生产。有研究将RTAD和RIDD融合到HpCrtW或HpCrtZ的3'端,生成了模板化酶组分,然后引入解脂耶氏酵母以增强虾青素生产。定点突变用于定向修饰酶,提高其稳定性和底物特异性,是增强蛋白质工程中功能性属性的重要工具。有研究使用结构引导的蛋白质工程和定点突变获得了番茄红素环化酶的活性突变体,消除了底物抑制,实现了高产量的β-胡萝卜素。这些研究表明,酶的定向进化对途径通量有重要影响,为提高虾青素产量提供了新思路。
目前,在使用酵母平台生产虾青素方面已经取得了显著进展,如天然生产者红法夫酵母和工业酵母菌株解脂耶氏酵母和酿酒酵母已被应用于虾青素生产,并通过基因工程、代谢工程和合成生物学等许多不同的策略提高了产量。未来,蛋白质结构工程和高通量筛选方法将进一步促进高产菌株的发现,使虾青素的商业化生产更加可行。对代谢途径的精确管理,加上丰富的数据和计算工具,包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学,将使虾青素的大规模商业生产成为可能。
参考资料:
https://doi.org/10.1007/s12033-