β-甘露聚糖酶的基因工程技术研究

  中国农业科学院饲料研究所/丁宏标 乔宇

  广州立达尔生物科技有限公司/陈小兵

  原刊于《新饲料》杂志2006年第10期

    β-甘露聚糖酶是近年来饲料用酶制剂研究的热点之一，也是近10年来在美国应用最广泛的饲用酶制剂之一（Hashem等，2001；Kurakake等；2001；Parker等，2001）。β-甘露聚糖酶（β-mannanase EC 3.2.1.78）是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。β-甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括植物、细菌、真菌、放线菌甚至软体动物（Hashem等，2001；Kurakake等；2001；Parker等，2001；陈小兵等，2004，2005）。甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚糖之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，而且在许多植物中有如淀粉样的大量积累（Chesson，1987；李欣等；1980）。畜禽和鱼类的消化酶系不含甘露聚糖酶，对这类物质的转化需要添加外源酶。饲料中添加甘露聚糖酶可补充内源消化酶不足，消除和降解饲料原料中的抗营养因子，促进畜禽生长，减少养殖污染。甘露聚糖类物质用酶处理，也可生产高品质的甘露寡糖产品。

1  β-甘露聚糖酶菌种选育

    国内自20世纪80年代开展微生物甘露聚糖酶发酵生产技术研究，进展很快。1980年我国李欣等首次系统研究甘露聚糖的化学组成。1985年以后，随着β-甘露聚糖酶和甘露寡糖应用领域的开发，新菌种筛选和诱导育种等相关研究竞争显著加剧。如杨文博等（1995）研究了产β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌的分离筛选及发酵条件。崔福绵等（1999）研究了枯草芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的产生及性质，选育菌种的酶产量达到120 U/ml。我国另一具有特色的工作是分泌β-甘露聚糖酶的分离选育。如中国科学院微生物研究所马延和等（1991）较早提出利用极端微生物菌种分泌的碱性β-甘露聚糖酶生产甘露寡糖的方法。利用嗜碱芽孢杆菌N16-5以魔芋粉为原料，发酵生产β-甘露聚糖酶，发酵液的酶活力达到500 U/ml，甘露寡糖后提取收率80%以上。

    丁宏标等从1995年开始饲用酶菌种筛选工作，分离得到一株能分泌酸性β-甘露聚糖酶的黑曲霉。其分泌的β-甘露聚糖酶，工作温度30～85℃，最适反应温度70℃，反应pH 2～9.2，最适pH 3.0～5.8；摇瓶条件下酶活力达到150 U/ml，符合饲料用酶条件。该菌种、发酵工艺、及甘露寡糖和酶的应用方法已申请中国发明专利。

2  甘露聚糖酶的工业生产和基因工程的研究进展

    国内外对β-甘露聚糖酶、甘露寡糖生产方法的研究涉及酶的生产、纯化与特性研究、基因克隆与重组表达以及甘露寡糖的酶法生产等方面。生产技术方面的标志性进展有：1987年日本理化研究所对芽孢杆菌AM-001的β-甘露聚糖酶，通过多种方法选育，酶活力由36 U/ml提高到了430 U/ml。1995年，美国ChemGen公司研制了一种β-甘露聚糖酶，其菌种Bacillus lentus 的产酶能力达400 U/ml，随后开发用做饲料添加剂，是目前美国销量最大的饲料用酶（美国专利号96107126.5）。

    β-甘露聚糖酶基因工程方面的研究已有成功报道。有一些β-甘露聚糖酶被克隆，并在大肠杆菌中表达，如Mendoza等（1995）将克隆自Bacillus subtilis NM-39的β-甘露聚糖酶基因转入大肠杆菌DH5a表达，重组酶活力为4.9 U/ml。还有其它微生物来源的基因，如嗜碱芽孢杆菌（Alkalophilic Bacillus sp.）AM-001、极端嗜热厌氧菌、荧光假单孢菌、变青链霉菌以及里氏木霉等，在大肠杆菌中表达成功。大多数β-甘露聚糖酶除了有催化功能域，同时具有纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD），因此属于纤维素－半纤维素双功能基因家族。由于植物纤维素与半纤维素总是相伴存在，CBD有利于酶更好的结合靶物质，也有利于破坏植物聚糖的晶体结构，促进水解（Hagglund等，2003）。

    用大肠杆菌表达主要证明酶基因的活性功能，人们也在进行β-甘露聚糖酶基因在酵母中的表达。由于在酵母系统中表达的蛋白在糖基化、磷酸化等方面的优越性远高于在大肠杆菌中表达，所以这些工作更有吸引力。Stalbrand等（1995）利用从Trichoderma reesei克隆的β-甘露葡聚糖酶基因在酿酒酵母中实现了重组表达。Tang等（2001）用毕赤酵母表达来源于Agaricus bisporus strain C54-carb8的甘露聚糖酶基因cel4，表达量提高了3倍。现在NCBI的Genebank和EMBL基因库中已列入近百种不同来源的β-甘露聚糖酶基因。不同来源的β-甘露聚糖酶基因分别在原核表达系统和真核表达系统中进行了表达，其中对于在大肠杆菌表达系统表达的β-甘露聚糖酶，活力最高的酶基因来源于一株芽孢杆菌，酶活力可达41.8 U/ml（谭秀华等，2005）。在酵母表达系统表达的β-甘露聚糖酶活力最高的酶基因来源于一种海洋软体动物（Mytilus edulis）的甘露聚糖酶基因，在14L的发酵罐中表达量达到900 mg/l，酶的比活力为45.6U/mg（Xu等，2002）。总体来说，酶的表达量偏低，达不到工业生产的要求。

    近年来我们一直致力于β-甘露聚糖酶的资源开发，自1995年分离得到一株能分泌酸性β-甘露聚糖酶的黑曲霉后，利用生物技术不断构建产β-甘露聚糖酶的基因工程菌株。我们从一株产β-甘露聚糖酶的芽孢杆菌克隆到β-甘露聚糖酶基因，将其插入到巴斯得毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得了重组表达载体pMAN22，转化巴斯德毕赤酵母，筛选得到了高效分泌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌MAN22。在5l发酵罐发酵酶活力可达110，0000U/ml，是迄今报道酶活力最高的。目前已经完成小试，正在进行进一步的发酵优化试验。发酵酶液用载体颗粒吸附所制成产品的酶活力是和美酵素的7倍。MAN22所产甘露聚糖酶的活力明显高于目前国内外相关报道，达到国际领先水平，并且该酶的一些性质也适宜在动物的胃肠发挥作用，动物实验同时表明该酶具有良好的饲喂效果，具有工业化生产的巨大潜力。

3  β-甘露聚糖酶的应用

    甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分，在其他植物性饲料原料中含量也很高，如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的含量分别为22.7%，11.9%，19.6%和33.7%，在一些植物胶、椰子、莴苣、合欢、魔芋以及针叶树中也都含有丰富的甘露聚糖和异甘露聚糖（Chesson，1987；李欣等，1980）。这使得β-甘露聚糖酶的开发和利用具有重要的意义。

    由于畜禽和鱼类的消化酶系不含甘露聚糖酶，因此甘露聚糖类物质是一种主要的抗营养因子。微生物来源的β-甘露聚糖酶能以内切方式降解β-1，4糖苷键，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等，降解产物为甘露寡糖和甘露糖。已广泛证实β-甘露聚糖酶对动物的生长发育具有一系列积极作用。包括：1)促进动物生长,提高动物的饲料转化效率。β-甘露聚糖酶可提高肉鸡增重4.4%～10.3%，饲料转化率2.9%～6.0％，提高肉猪增重4.2%～8.6%,饲料转化率4%～9%（Chesson，1987；Nelson等，1996；Jackson等，1999；Pettey等，2002；Jackson等，2003；Lee等，2003；Daskiran等，2004）；2) 甘露聚糖酶可以促进养分消化,改善动物肠道微生物生态,改善动物体的健康状况。玉米－豆粕日粮中添加0.1%甘露聚糖酶可使肉鸡盲肠沙门氏菌数量比对照减少12%（Jackson等，2004）；3) 甘露聚糖酶可以降低肠道内容物的粘稠度，减少粪便排泄，减轻环境污染（Chesson，1987；Jackson等，1999；Pettey等；2002；Jackson等，2003）；4) β-甘露聚糖酶可以提高微量元素的生物利用率。甘露聚糖吸附微量元素,抑制其消化吸收（Chesson，1987；Jackson等，1999；Jackson等，2003）；5) β-甘露聚糖酶降解产物甘露寡糖可促进动物肠道有益菌的生长；6) β-甘露聚糖酶及降解产物甘露寡糖可正向刺激机体免疫活性；7)降解产物甘露寡糖还能够吸附真菌毒素，减少抗生素等化学药物的使用，是生产绿色动物食品的添加剂。

    我国猪鸡的主要日粮是玉米－豆粕型日粮，其主要的抗消化粘性多糖是甘露聚糖。玉米和豆粕中甘露聚糖占非淀粉多糖的比例分别为11.7%和22.7%。大豆多糖可吸收自身重量七倍的水，并吸附多种微量元素，降低其生物利用率。β-甘露聚糖酶是对玉米－豆粕型日粮非常有效的饲用酶制剂，它可以降解其含有的抗消化粘性多糖，促生长提高饲料利用效率的效果非常显著（表1）（Chesson，1987；Pettey等，2002；Jackson等，2003；Lee等，2003；Daskiran等，2004；Jackson等，2004）。

表1  β-甘露聚糖酶对玉米－豆粕型日粮的应用效果

    美国ChemGen公司开发的β-甘露聚糖酶产品Hemicell®是国际市场上应用最广泛的饲用酶制剂之一，也是目前世界上用于玉米－豆粕型日粮的销售量最大的酶制剂，其在中国的商品名是和美酵素。目前有关β-甘露聚糖酶的应用研究主要集中在北美和欧洲进行，大多是关于美国ChemGen公司生产的β-甘露聚糖酶，结果显示其在玉米－豆粕型日粮中效果显著。

    酶法分解制备甘露寡糖，是β-甘露聚糖酶应用研究的重点内容之一。但一些β-甘露聚糖酶专业性不强，转化率不太高。目前相当一些甘露寡糖产品是啤酒酵母提取物，如美国奥特奇公司销售的此种产品，寡糖含量为65%。目前我们正在分离高效的β-甘露聚糖酶基因，酶解魔芋甘露聚糖、田箐胶等制备甘露寡糖，希望较大幅度降低生产成本。同时利用基因工程技术制备高活性β-甘露聚糖酶，提高酶的产量，进一步降低成本，推进甘露聚糖酶和甘露寡糖在饲料中的应用。

4  展望

    β-甘露聚糖酶和甘露寡糖的推广应用，符合生态养殖业的需要。它们还可广泛应用于食品、纺织、石油等工业领域，如甘露寡糖是最有效的双岐因子之一，可以口服，国内外已经广泛地用于保健食品中。β-甘露聚糖酶还可用于从豆类植物中提炼植物油，降低咖啡、巧克力、可可液的粘性。β-甘露聚糖酶和木聚糖酶协同作用可用于造纸工业。β-甘露聚糖酶还可作为石油压裂液的破胶剂，具有效力高、成本低、对地层伤害小等优点。特别是利用该酶来水解魔芋以制备高纯度的甘露寡糖，其市场前景十分广阔。作为生产原料的魔芋广泛分布于四川、云南、贵州、湖北西部等欠发达的地区，该酶的大规模生产对于科技扶贫也有着重要的推动作用。因而，近年来β-甘露聚糖酶的研究逐渐成为了国内外的研究热点。但是国内各有关科研单位的研究大多限于实验室阶段，所报道的发酵酶活低，酶解产物组成不稳定，生产成本较高，难以取得竞争优势。筛选高比活酶基因，应用基因工程技术构建高效产酶的微生物，进行分子育种改良酶的性质，优化寡糖的酶解制备工艺，是国际上的研究热点和方向，也具有很好的科学意义和应用前景。