(四川大学化工学院制药与生物工程系，成都，610065)
摘 要：本文概述了国内外近几年来在基因重组药物基础领域及其发酵工程上的发展情况。
关键词：基因重组药物发酵工程肿瘤免疫性疾病心血管疾病
1 前言
生物技术是以生物化学、分子生物学、细胞生物学、分子遗传学等生物科学的基础理论与基因工程、细胞工程、酶工程等相互交叉结合的科学技术体系。现代生物技术与信息技术、新材料技术、新能源技术并列为21世纪的四大科学技术核心，它的发展将为当代重大疾病诊疗创造更多的有效药物，并在所有前沿性的医学空间形成新领域。
从技术的观点讲，生物技术是发酵工程技术的延拓和扩展，尤其是自上个世纪40年代青霉素和链霉素的大规模生产以来，化学工程师已越来越多地介入微生物发酵工程，大大促进了生物化学工程学科的发展。生物技术产品的工业化多半要仰赖于发酵工程技术，而基因重组技术的迅猛发展对发酵工程技术及其工程师提出了更高的要求。因此，作为生物化工主体的发酵工程技术就成为大部分生物技术药物工业化生产的一个关键。
2 进展
在美国，生物技术药物(biotechdrugs)或称生物药物(biopharmaceutics)研究的主攻目标首先是癌症诊疗药物，研究中的品种有151个，已批准14个；其次是侵袭性疾病药物，研究中的有65个，已批准17个；第三是自身免疫性疾病及器官移植免疫排斥药物，研究中的有35个，已批准8个；然后是心血管疾病等方面的药物。现将肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病等基因重组药物的构建及其发酵工程情况分述如下。
2.1 抗肿瘤药物
在全世界，肿瘤死亡率居各病之首，美国每年被诊断为肿瘤的患者为100万，死于肿瘤者达54.7万，用于肿瘤的治疗费用1020亿美元。肿瘤是多机制的复杂疾病，目前仍用早期诊断、放疗、化疗等综合手段治疗，但存在着对病人的毒副作用大，效果不明显等缺点。而生化技术药物在对付多机制复杂病方面有着同类药物不可替代的优势。据估计，今后10年抗肿瘤生物药物会急剧增加，其中的大部分是通过发酵工程实现工业化生产的。
肿瘤坏死因子a(TNFa)是一种重要的细胞因子，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，对多种肿瘤细胞均有细胞毒性及增殖抑制活性，但其极为严重的全身毒性反应如发热、消瘦、感染性休克、低血压及器官衰竭等，使人们试图将TNFa用作抗肿瘤药物的希望破灭了。
基因重组技术给人们带来了新的希望，重组人TNF是比天然TNFa毒副作用小的TNF衍生物，经大量动物实验证明，这种新型肿瘤坏死因子对多种肿瘤组织和细胞的杀伤作用优于天然TNFa，对于机体的急性和慢性作用比天然TNFa显著降低。中试发酵TNF的表达产物占到了菌体总蛋白的60左右，且大部分以可溶形式存在。因此在不久的将来，它有可能成为一种有效的抗肿瘤药物应用于临床。
内皮细胞生长抑制素(Endostatin)能够促进肿瘤内新生血管内皮细胞的凋亡，抑制新血管的生成以及抑制肿瘤的生长和转移，最终使肿瘤缩小或者消失。利用生物反应器对重组质粒转化毕赤酵母SMD1168细胞进行高密度发酵，Endostatin的产量可达125mg／L ，纯化后的Endostatin具有抑制小鼠血管内皮细胞增殖的活性。
吴江雪等采用表达载体Ppic9k，在毕节酵母GSl15中表达人内皮细胞抑制素，并在30I 生物反应器中对酵母工程菌进行高密度发酵，经甲醇诱导48h，生物量达到250OD，分泌量为150mg／L ，建立了发酵和纯化工艺，为内皮细胞抑制素的工业化生产打下了基础。另外有研究结果表明，使用毕赤酵母表达产生的分泌蛋白ANGPTL4对人脐静脉内皮细胞EVC304具有生长抑制作用。
这一结果提示了ANGPTIA可能参与了血管的新生，而新血管的生成是实体肿瘤得以迅速生长和转移的基础，利用高效的抑制因子如血管抑制素(Angiostatin)抑制血管生成以切断肿瘤的营养供应，达到抑制和治疗肿瘤的目的是目前肿瘤药物研制的热点。
肿瘤细胞侵袭转移是恶性肿瘤病人死亡的主要原因，尿激酶型纤溶酶原激活剂系统(uPAuPAR)在血管形成、组织重建、伤口愈合、肿瘤侵袭和转移中发挥着重要作用。将人ATF-PAI2 CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF-PAI2CD)克隆到酵母细胞表达载体Ppic9k，获得融合基因表达质粒pZWYATF-PAI。CD，ATF-PAI。
CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达，用摇瓶发酵表达产物ATF_PAI2 CD占培养液中总蛋白50%以上，且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能，提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景。通过干扰uPAuPAR的相互作用和抑制uPA活性来抑制肿瘤细胞侵袭转移，成为抗肿瘤侵袭转移治疗的又一新思路。
自由基也是癌症的重要诱导因素之一。以抗自由基而著名的外用多糖EPS2，由于在自由基清除和抗氧化活性方面表现比较优秀，因此其作为一种药物治疗由于自由基引起的对生命可能造成极大损害的疾病。如癌症、动脉粥样硬化形成等方面具有极大的潜力。Cheng Suna等使用丝状菌Keissleri—ella sp.YS 4108进行发酵实验生产EPS2，并在250L的发酵罐中放大，发现选用这种体系具有更好的应用价值。
CD20是一个比较成熟的B细胞表面标记，其特异性表达在正常前B细胞以后的分化全过程(浆细胞时消失)，以及相应的恶性B细胞肿瘤细胞上；在其它组织中均无CD20的表达，在人血清中也无游离CD20的存在，因此CD20可作为B淋巴细胞瘤治疗的一个很好的选择性治疗靶点。
转化了质粒PYZcpp 3的16C9大肠杆菌可高水平地分泌表达可溶性CD20F(ab’)2抗体，而F(ab’)2可以特异性地识别CD20细胞并与CD20相结合；在发酵罐内进行高密度培养的产量为241mg／L，其中F(ab’)2片段达50％，使其大规模生产成为可能，而且其活性与摇瓶培养的抗体生物活性基本一致。肿瘤组织来源的热休克蛋白(Hsp)肽复合物能够激发特异性抗肿瘤免疫，但因其纯化复杂和来源受限大大限制了它的应用。
现已证实在体外重组的Hsp胞(CTL)效应，将结核杆菌Hsp70克隆到酵母表达载体Ppic9k中，应用毕赤酵母表达系统，以胞外分泌的方式表达了Hsp70，为进一步研究制备结核杆菌Hsp70抗原肽疫苗以及结核杆菌Hsp70与抗原肽的融合蛋白疫苗提供物质基础。
随着国内外对人血小板因子4(hPF4)的深入研究，发现PF4不仅在调节炎症、血管生成、造血、细胞增生、止血等方面扮演重要角色，而且在骨髓细胞保护、血管生成抑制、肿瘤治疗等方面也具有重要的作用。hPF4能支持造血干细胞生长，降低细胞对细胞毒剂的化学敏感性，对红系、巨核系均有作用；可通过对内皮细胞周期、成纤维细胞生长因子2及其相应受体的作用抑制内皮细胞生长，抑制血管生成；还可通过多种机制抑制肿瘤的生长。张俊芳等通过生物技术将人血小板因子4在大肠杆菌中进行了高效表达，对其活性的研究表明，表达产物有较高的生物活性。
2.2 免疫相关药物
B干扰素(IFNp)是由成纤维细胞或巨噬细胞受病毒感染或诱生剂诱导产生的细胞因子，具有抗病毒、免疫调节及抗增殖的作用。由于Escherichiacoli表达的rhIFNβ缺乏糖基化修饰过程，导致其生物活性受到一定的影响。
有文章报道了以酵母菌作为工程菌，发酵表达糖基化的rhIFNβ，并以交联抗rhIFNβ单克隆抗体的免疫亲和层析柱和蓝谱亲和层析(BlueS6FF)纯化发酵上清液中的rhIFNβ，高效地提取了酵母菌的基因表达产物，同类药物干扰素(IFN—αlb)在大肠杆菌工程菌中高效表达量为菌体总量的30％左右。
白细胞介素IL-7是适应性免疫应答的细胞因子，在人类T淋巴细胞的成熟中起着重要的作用，在免疫降低的病人中有着潜在的治疗价值，如化疗、放疗、爱滋病和骨髓移植等。通过基因重组技术使E.coli HMS174(DE3)pLysS高效表达了人白细胞介素rhIL一7，经过提纯分离后的净产品具备生物活性，其纯度大于95％，内毒素低于0.05EU／ml ，最大的产量可达10mg／L。
趋化因子(Chemokine)是一类对免疫细胞具有趋化作用的细胞因子。病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ(vMIPⅡ)是由柯氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)，亦即人疱疹病毒8(HHV 8)基因组编码的趋化因子，vMIP II能与作为HIV感染的辅助受体的趋化因子受体结合，干扰HIV的gp120与辅助受体的结合而可以抑制HIV的感染。
vMIP II也是多种趋化因子受体如CCR2、CCR 5、XCR4、CX3CR等的天然拮抗剂，能广谱地结合多种趋化因子受体，干扰和阻断趋化因子受体的正常结合及后续的信号传导，导致趋化因子的功能丧失。以Pet32a(+)为重组趋化因子vMIP II的表达载体，在大肠杆菌中表达一个硫氧环蛋白(thioredoxin)vMIP II的融合蛋白，经酶切、纯化后，获得了高纯度的生物学活性的蛋白vMIPII。
人乳铁蛋白具有广泛复杂的生物学功能，其脱铁形式是一种多功能的免疫调节物质，是人体非特异性黏膜免疫系统中重要的非抗体保护蛋白，在抗感染抗炎症的第一线发挥作用；特别是其广谱而独特的抗微生物活性，已使之成为抗菌、抗病毒类新药设计的重要候选物。
由于自然状态下人乳铁蛋白含量稀少，且从人乳中纯化成本极高，因此利用基因工程技术制备是唯一的途径。筛选获得的重组甲醇营养型酵母(Pichia pastoris)p35k7补料分批发酵的重组人乳铁蛋白最高表达量为115mg／L ，其进行规模化工业生产的基础已经具备。
乙肝是严重威胁人类健康的疾病之一，我国有超过1亿的HBV携带者。1971年S.Krugman首次证明了乙肝病人血浆中的病毒表面颗粒(HBsAg)可抵抗HBV的攻击，促成了乙肝疫苗研制的开始。抗体antiHBsAgFab是完全人源化的第3代基因工程抗体，具有相对分子质量小，体内扩散性好，不产生人抗鼠抗体反应等特点，在临床上有着极大的应用前景。
第一军医大学的学者们进行了antiHBsAgFab含表达载体的工程化大肠杆菌的大规模培养，在25℃条件下以0.2％阿拉伯糖诱导12h，Fab的得率最佳，采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大D600达到55.2，相当于湿菌含量110g／L水平。而将汉逊酵母系统作载体表达rHBsAg，发酵生产稳定性好，rHBsAg颗粒表达量达400μg／mL，最终纯化的rHBsAg达60μg／mL，并且因其免疫原性和安全性好、表达量高、成本低、易大批量生产，所以值得开发利用。
神经生长性因子(NGR)是神经细胞生长、分化、修复不可缺少的细胞因子，越来越多的研究发现其在免疫反应、肿瘤分化等过程中也起着重要的作用。对人含前导肽β-NGR的基因序列进行体外扩增克隆及分析鉴定并将其插入Pichia酵母分泌型表达载体pPic9K中进行表达，表达量占菌体蛋白的30％，生化检测表明，此带有特异活性结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高，且具有免疫活性引。
幽门螺杆菌(Hp)感染致病的第一步是粘附定居，介导Hp粘附过程的粘附因子称为粘附素，是细菌粘附定居的物质基础，研究表明N乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维血凝素(NLBH，HpaA)是Hp的主要粘附素之一。重组幽门螺杆菌粘附素基因工程菌的最新发酵工艺可使15L发酵罐发酵工程菌菌体收获量可达48.2g／L，目标蛋白表达量约占总蛋白的31.5%。
E.coli O157：H7能够产生两种毒素(VT1、VT2)，这两种含有A、B两亚基的毒素能导致出血性大肠炎，有时还会出现尿毒症，甚至威胁生命。将能够表达B亚基(VT2B)的E.coli基因在细菌中表达，其产物在小鼠实验中显示了对VT毒素具有选择性免疫，所以在其它方法作用不大的情况下，开发这种新型疫苗来预防E.coli O157：H7导致的疾病是很有价值的。
2.3 心血管药物
水蛭素能特异性地与凝血酶结合，是迄今为止已发现的对凝血酶抑制作用最强的抗凝药物，能够有效地预防和治疗冠状动脉疾病、静脉血栓、弥散性血管内凝血等疾病。由于肝素易与血小板反应，使用肝素病人中部分会出现肝素诱导的血小板减少症(HIT)，能导致血栓栓塞综合症等疾病。而水蛭素不与血小板反应，在治疗HIT方面具有其它抗凝药物无法比拟的效果。在5L发酵罐中重组毕赤酵母能够高密度发酵产生水蛭素，最高总产量1.8g／L，为大规模工业化铺平了道路。
灰树花(Grifola frondosa)是一种天然珍稀药用真菌，富含蛋白质、维生素等多种营养物质。近年来发现灰树花中的多糖类物质具有抗肿瘤、抗HIV病毒，免疫调节等多方面生理活性功能。灰树花液体深层发酵菌丝体经热水完全提取，剩余残渣用2%NaOH浸泡提取，提取液分别经乙醇沉淀、H2O2除色素、去蛋白、透析、DEAE SepharoseFastFlow 柱层析分离纯化，可得到碱提水溶性多糖GAP。
药理实验表明，灰树花发酵液GFL在160或80mg／kg的剂量下，胞内多糖纯化物GIP在40、20、10mg／kg的剂量下，具有较显著的调节血脂作用。
MycobacteriaHsp65近来由于其作为卡介疫苗(BCG)来治疗肺结核而被关爱有加。研究表明线性蛋白CETPC可被Hsp65羧基末端所连接携带而在E.coli中以可溶性蛋白高效表达，将Hsp65-CETPC通过注射给实验小鼠，发现CETPC特异抗体被激发，并在体内持续达到12周，这充分地说明Hsp65可以作为诸如CETPC等异己多肽抗原决定基蛋白分子的有效载体而送达人体免疫系统。因此，在不久的将来，Hsp65-CETPC有希望作为动脉粥样硬化的一种预防疫苗。
3 结束语
基因重组药物在攻克一些疑难杂症以及传统制药技术无法作为的领域将大有用武之地。基因重组药物与大多数传统药物相比有很大的不同，比如具有大分子量、多级分子结构等，而特定的结构决定着蛋白质的具体功能。
所以在现代生物技术制药中，各种高分子蛋白的结构与功能及其相互的关系被高度地关注，更多的工程技术手段被引入用以改变分子的结构以达到特定的某种功能目的；一些原本比较难实现的药物生产方式将有可能成为现实，如通过基因整合产生GnRH(促性腺激素释放激素，gonadotrophin-releasing hormone)-hinge- MVP(麻风病毒蛋白，measles virus protein)双链分子，使GnRH在E.coli.中高效表达。
但目前的进程显示，这些生产过程普遍存在着产物表达率低、发酵过程难控制、产物难分离提纯等一些亟待解决的问题。因此优化表达条件、加强发酵控制和改进分离提纯方法是摆在基因工程师、发酵工程师和分离纯化工程师面前亟待解决的难题。
